Wnt/β-catenin通路对大鼠脑出血的保护作用*

李治华，陈　曦，臧卫东，郭付有#

1)郑州大学基础医学院人体解剖学教研室 郑州 450001　2)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州 450052



Wnt/β-catenin通路对大鼠脑出血的保护作用*

李治华1)，陈曦2)，臧卫东1)，郭付有2)#

1)郑州大学基础医学院人体解剖学教研室 郑州 4500012)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州 450052

关键词脑出血；Wnt/β-catenin通路；RNA干扰；脑保护；大鼠

摘要目的：探讨Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路对大鼠脑出血的保护作用机制。方法：96只成年SD雄性大鼠随机分为假手术组、脑出血组、脑出血假干预组、siDkk-1干预组4组，采用Real-time PCR方法检测各组大鼠脑出血后24、72 h脑组织中Wnt-1和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β) mRNA表达的变化，采用Western blot法检测各组大鼠脑出血后24、72 h脑组织中β-catenin表达的变化，各组大鼠处死前均进行行为学检测。结果：大鼠脑出血后24和72 h，Wnt-1 mRNA水平与假手术组相比均降低，经siDkk-1干预后，Wnt-1 mRNA 水平较脑出血假干预组升高(F=9.040和26.400, P均<0.05)。大鼠脑出血后24 和72 h，GSK-3β mRNA 水平与假手术组相比均升高，经siDkk-1干预后，GSK-3β mRNA水平较脑出血假干预组下降(F=41.100和17.800, P均<0.001)。大鼠脑出血后24和72 h，β-catenin蛋白的表达较假手术组均升高，经siDkk-1干预后，其表达较脑出血假干预组进一步升高(F=15.100和14.000, P均<0.05)。大鼠脑出血后24和72 h，刺激触须前肢上抬比例较假手术组降低，经siDkk-1干预后，前肢上抬比例较脑出血假干预组升高(F=2 450.000和2 230.000，P均<0.001)。结论：Wnt/β-catenin通路对脑出血大鼠有保护作用，可能是通过活化Wnt-1、抑制 GSK-3β，进而导致β-catenin 在胞浆中聚集、移位入核后启动Wnt下游靶基因的转录所致。

AbstractAim: To investigate the neuroprotective effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on intracranial hemor rhage(ICH) in rats.Methods: A total of 96 adult SD rats were allocated into sham-operation group,ICH group,ICH+vehicle-treated group,and ICH+siDkk-1 group.The mRNA expressions of Wnt-1 and GSK-3β were assessed by Real-time PCR at 24 and 72 h after ICH respectively. The expression of β-catenin was evaluated by Western blot analysis. Behavioral test was performed by the vibrissae-elicited forelimb-placing test in different groups.Results: There were remarkably down-regulated expression of Wnt-1 mRNA following ICH at 24 and 72 h, and the mRNA level of Wnt-1 was elevated after siDkk-1 administration(F=9.040 and 26.400, P<0.05). Increased GSK-3β mRNA expression was observed at 24 and 72 h after ICH, and the mRNA level of GSK-3β were reversed after siDkk-1 administration(F=41.100 and 17.800, P<0.001). Western blot analysis showed that β-catenin protein was increased at 24 h and 72 h after ICH respectively, and the level of β-catenin was further up-regulated after being treated by siDkk-1 compared with ICH+vehicle-treated group(F=15.100 and 14.000, P<0.05). Meanwhile, decreased behavior scores regarding forelimb use asymmetry was found in the ICH group. However, the behavior scores regarding forelimb use asymmetry was improved after siDkk-1 administration than those in the ICH+vehicle-treated group at 24 and 72 h after ICH(F=2 450.000 and 2 230.000, P<0.001).Conclusion: Wnt/β-catenin signaling pathway has neuroprotective effects against secondary brain injury following ICH, which may be associated with activation of Wnt-1, inhibition of GSK-3β resulting in β-catenin aggregation in the cytoplasm,subsequent nuclear translocation and the downstream neuroprotective gene transcription.

脑出血是临床上严重威胁人类生命的最常见的脑血管疾病之一。研究[1-2]发现：Wnt信号转导通路在蛛网膜下腔出血和脊髓损伤后均能发挥重要的神经保护作用。Dickkopf-1(Dkk-1)是调控Wnt通路的关键负性因子[3-5]，在正常脑组织中很少表达，但在缺血性脑卒中被强烈诱导表达。应用 Dkk-1的拮抗剂或中和抗体诱导Wnt经典通路激活，在缺血性脑卒中发挥了脑保护作用[6]。此外，有研究[7]报道，视网膜神经细胞可以通过Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的激活对光所致的感受器损害具有神经保护作用；相反玻璃体内注射Dkk-1能够使视网膜Wnt/β-catenin通路的保护作用消失。研究[8]发现，Wnt/β-catenin通路不仅可诱导脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表达，而且在调控血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的发育及促进BBB的脑内皮细胞完整性方面发挥重要作用[9-10]；而诱导BDNF表达可促进神经功能恢复和维持BBB稳定性，进而减轻血管源性脑水肿，对神经有显著的保护作用。目前有关Wnt通路在大鼠脑出血中的表达及能否对脑出血产生神经保护作用均未见文献报道。因此，该研究拟通过构建表达Dkk-1靶向小干扰RNA(siDkk-1)的慢病毒载体对脑出血大鼠进行干预，探讨激活Wnt通路能否发挥神经保护作用，从而为临床治疗脑出血提供新途径。

1材料与方法

1.1实验动物及模型制作选用河南省实验动物中心提供的体重275~300 g、成年SD雄性大鼠，共96只，经腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉后固定在脑立体定位仪上，于前囟前0.2 mm、中线向右旁开3.5 mm处钻一直径1 mm的骨孔，用26号针头经骨孔垂直进针，深度5.5 mm，到达基底节区，用微量注射泵将提前抽取的大鼠股动脉血(100 μL)缓慢注入右侧基底节区，留针10 min以防血液沿针孔溢出，无菌骨蜡封闭骨孔，缝合切口。具体方法参见文献[11]。

1.2表达Dkk-1 siRNA慢病毒载体的构建按照Elbashir等[12]提出的RNAi序列设计原则，结合慢病毒载体的特征，由上海锐劲生物技术有限公司合成针对Dkk-1的慢病毒包裹的特异siRNA片段，实验用量为2×107个传导单元(transducing units，Tu)。

1.3动物分组及处理实验共分为假手术组、脑出血组、脑出血假干预组、siDkk-1干预组4组，每组24只；其中每个时间点(24、72 h) 取6只大鼠采用Real-time PCR检测Wnt-1、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)基因表达的变化，其余动物用Western blot检测脑组织中β-catenin蛋白表达的变化；不同组别大鼠处死前均进行行为学检测。假手术组留置注射针而不注射血液。siDkk-1干预组于制作脑出血模型前2 d，术侧脑室(脑室立体定位坐标参考前囟后1.5 mm、中线旁开1.0 mm、脑表面下3.2 mm[13])给予体外成功构建且稳定表达的siDkk-1的慢病毒载体10 μL。脑出血假干预组给予转染试剂包裹的无关序列10 μL。

1.4大鼠脑组织中Wnt-1、GSK-3β mRNA水平检测Trizol法提取脑组织总RNA，检测浓度后取1 μg，根据逆转录试剂盒(TaKaRa公司)说明进行逆转录反应，得到cDNA，再进行Real-time PCR反应，PCR反应体系为：SYBR Premix EX Taq(2×)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL(表1)，ddH2O 7 μL，总体积20 μL。Real-time PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；然后72 ℃延伸10 min。根据各个样本PCR反应的Ct值进行相对定量。脑出血组和siDkk-1干预组目的基因的表达水平分别用其相对于假手术组和脑出血假干预组相应基因表达水平的倍数来表示(2-ΔΔCt)，具体操作方法参照文献[14]。

表1　引物序列和扩增产物大小

1.5大鼠脑组织中β-catenin蛋白表达的Western blot检测大鼠麻醉后灌注处死，取出大脑，在额极后方4 mm处切取3 mm厚的冠状切片，取血肿周围1 mm外脑组织(以防血液污染)，然后将取得的理想标本置入0.5 mL蛋白裂解缓冲液内并超声打碎，持续30 s，离心15 min，取10 μL上清液用于蛋白质浓度分析，其余上清液加蛋白上样缓冲液混匀煮沸，取50 μg的蛋白样品加入到聚丙烯酰胺电泳槽内电泳，然后转移到硝酸纤维素膜(PVDF)膜上，脱脂牛奶封闭2 h后，依次加入β-catenin一抗(按11 000稀释，Cell Signaling Technology公司)和β-actin一抗(按13 000稀释，北京锐抗生物科技有限公司)、二抗(按12 000稀释，均为上海威奥生物科技有限公司产品)，TBST彻底清洗PVDF膜，加ECL超敏化学发光试剂后立刻在FluorChem E机器上进行曝光，依据条带的相对灰度值判断蛋白的表达水平。

1.6行为学检测采用刺激触须前肢上抬实验进行大鼠行为学评估：观察大鼠在轻触患侧触须时，对侧前肢上抬并成功触及桌面的情况，重复10次。当右侧基底节受损时，大鼠左侧前肢出现无力症状，计算左侧上肢成功上抬的比例。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组大鼠不同时间点脑组织中Wnt-1和GSK-3β mRNA、β-catenin蛋白表达的变化以及行为学的变化，检验水准α=0.05。

2结果

2.1各组大鼠不同时间点脑组织中Wnt-1 mRNA表达水平的变化见表2。

表2　各组大鼠不同时间点

*：与脑出血假干预组相比，P<0.05。

2.2各组大鼠不同时间点脑组织中GSK-3β mRNA表达水平的变化见表3。

表3　各组大鼠不同时间点

*：与脑出血假干预组相比，P<0.05。

2.3各组大鼠不同时间点脑组织中β-catenin蛋白表达水平的变化见表4。

表4　各组大鼠不同时间点

*：与脑出血假干预组相比，P<0.05。

2.4各组大鼠不同时间点行为学检测结果见表5。

表5　各组大鼠不同时间点行为学检测结果　%

*：与脑出血假干预组相比，P<0.05。

3讨论

经典Wnt通路又称Wnt/β-catenin通路，在存在Wnt配体的情况下，抑制GSK-3β，导致β-catenin在胞浆中聚集，随后移位至胞核。在细胞核内，β-catenin与TCF/LEF转录激活因子结合，激活Wnt下游靶基因的转录，进而参与多种疾病的病理生理变化。该研究结果显示：大鼠脑出血后Wnt-1 mRNA水平降低，GSK-3β mRNA水平升高，β-catenin蛋白表达升高；经siDkk-1干预后，Wnt-1激活，GSK-3β被抑制，β-catenin进一步升高，同时改善了脑出血大鼠的行为学表现。行为学表现的改善表明激活的Wnt通路在脑出血早期具有脑保护作用；此外，作者前期的动物实验(待发表)发现siDkk-1通过激活Wnt通路，能够减轻伊文蓝外渗和脑组织含水量，说明Wnt通路的激活可能通过诱导β-catenin的大量表达，进而启动Wnt下游靶基因的转录，促进受损BBB一定程度的修复，发挥了脑保护的作用。

作者在研究中还发现，大鼠脑出血后Wnt-1 mRNA和β-catenin蛋白表达趋势不完全一致：大鼠脑出血后Wnt-1被抑制，但是与假手术组相比，β-catenin蛋白升高，推测原因可能是除了Wnt-1 以外，还存在其他上调胞质β-catenin蛋白表达的信号通路，例如Wnt 蛋白家族的其他成员，如Wnt-3a、Wnt-8a、Wnt-8b等[15]亦通过稳定胞质β-catenin 水平来介导下游事件；此外PTEN、EGFR通路[16]或β-catenin 降解机制的异常也可导致β-catenin 在胞质浓度的升高，因此，胞质β-catenin受调节的因素很多，它的表达可不完全与Wnt-1一致。

Wnt/β-catenin 通路在脑出血中的表达目前文献报道极少。2014年Zhou等[17]发现脑出血后Wnt-3a和β-catenin分别在第3和7天达峰值，而且Wnt-3a/β-catenin表达与细胞凋亡呈显著正相关。但Wnt-1/β-catenin在脑出血中的表达及阻断Dkk-1表达是否对脑出血具有脑保护作用尚未见文献报道。鉴于Dkk-1是调控Wnt通路的关键负性因子，作者通过体外构建稳定表达Dkk-1 siRNA的慢病毒载体，对大鼠脑出血进行干预，结果发现：大鼠脑出血后脑组织内Wnt-1 mRNA表达下调，而经 siDkk-1干预后不仅能够激活Wnt-1 mRNA，使其表达上调，而且能够改善脑出血大鼠的行为学表现。该实验充分表明：通过应用靶向小干扰技术获得的siRNA治疗脑出血可能是未来脑出血治疗的新方向。

综上所述，Wnt通路活化能抑制GSK-3β的活性，从而使胞浆内β-catenin蛋白的水平升高，进而移位至胞核，激活Wnt下游靶基因的转录，发挥脑保护作用，改善行为学表现，但Wnt下游靶基因转录的具体机制还有待进一步研究。

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*国家自然科学基金资助项目30801133

Neuroprotective effects of Wnt/β-catenin signaling pathway on intracranial hemorrhage in rats

LIZhihua1),CHENXi2),ZANGWeidong1),GUOFuyou2)

1)DepartmentofHumanAnatomy,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2)DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsintracranial hemorrhage;Wnt/β-catenin signal pathway;RNA interference;neuroprotection;rat

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.006

中图分类号R743

通信作者#，男，1973年10月生，博士，主任医师，研究方向：脑血管病，E-mail：chyou666@hotmail.com