抗凝剂对体外诊断试剂检测结果的影响及其干扰研究方法

梁春滢 李小江 广东省食品药品监督管理局审评认证中心 （广东 广州 510080）

抗凝剂对体外诊断试剂检测结果的影响及其干扰研究方法

梁春滢 李小江 广东省食品药品监督管理局审评认证中心 （广东 广州 510080）

当体外诊断试剂预期用途明确，确定检测的临床样本类型为血浆或全血时，申请人在产品说明书中应同时明确样本添加的抗凝剂类型，并提供抗凝剂对检测结果是否产生干扰的研究性资料。该文主要基于临床样本常用抗凝剂的作用机制，和对体外诊断试剂使用过程的影响因素等，并结合《体外诊断试剂注册管理办法》等相关法规的要求[1]，来探讨抗凝剂在外诊断试剂的研发阶段及临床试验过程中的干扰研究方法。

抗凝剂影响因素 体外诊断试剂注册审评 干扰研究方法

抗凝剂常用于临床检验中对人全血样本或血浆样本的处理。不同种类抗凝剂的结构、性质差异较大，且作用机制不同，其选择则需根据临床检验中的具体项目和相应使用的检测试剂来定。不同的抗凝剂会影响血液不同的成分，或干扰检测试剂的主要成分，从而影响最终的检测结果。因此，一方面为提高体外诊断试剂在临床检测项目中结果的可靠性，另一方面在体外诊断试剂注册审评过程抗凝剂的干扰研究作为较为关键的环节，体外诊断试剂申请人应结合整个检测系统来严格评估抗凝剂的适用性。应当在体外诊断试剂研发及临床试验过程，根据产品的实际使用情况对抗凝剂进行干扰研究，并将干扰研究结果作为一项注册申报资料提交。下面将结合抗凝剂作用机制、对体外诊断试剂检测结果造成影响的因素等，提出注册审评过程对抗凝剂的关注点和干扰研究方法，供体外诊断试剂申请人参考。

1.常用抗凝剂的作用机制

临床检测项目中常用抗凝剂的作用机制主要分为两种：一是抗凝剂中相应结构会与抗凝血酶因子结合，提高抗凝血酶因子的活性，加速对凝血酶因子的灭活，从而抑制凝血酶原激酶的形成等达到抗凝的目的，如肝素等；二是与血液中的钙离子结合，形成螯合物或沉淀物，导致凝血过程无钙离子参与，从而阻断血液凝固的过程，如EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等[2]。

2.抗凝剂影响检测结果的途径

基于常用抗凝剂的作用机制、抗凝剂的结构特点及体外诊断试剂的组成成分等因素，简单总结临床检测项目中常用的抗凝剂影响体外诊断试剂使用过程的检测结果的主要途径。

2.1 通过影响体外诊断试剂的成分

化学发光、时间分辨荧光免疫等方法学的体外诊断试剂，通常其组成成分中含有标记物，而抗凝剂会与标记物相结合，影响该试剂成分的稳定性，从而影响整个检测系统的反应体系。如EDTA抗凝剂会与试剂组分中的铕标记物发生螯合反应，影响带标记物的抗原/抗体与被测物结合，从而影响检测结果。

2.2 通过影响血液样本中的成分

EDTA抗凝剂作为一种螯合剂，能络合血液成分中的阳离子，干扰血液样本中阳离子的浓度从而影响检测结果，故电解质分析用的体外诊断试剂应排除使用添加EDTA抗凝剂的样本。EDTA也会作用于冷抗血小板自身抗体，使得血小板发生聚集作用，造成血小板假性减少[3]。另外，草酸铵、肝素铵等铵盐类抗凝剂会增加血液样本中氮的成分，因此尿素、血氨等测定试剂是不宜用于添加铵盐类抗凝剂样本的检测。

2.3 通过影响血液样本中酶的活性

基于肝素抗凝的作用机制，其具有影响凝血酶活性的作用，因此不能用于血凝试验项目中。另外DETA、草酸能络合镁离子，形成螯合物，会抑制丙酮酸氧化酶、碱性磷酸酶等的活性[2]，故而对被测物为丙酮酸氧化酶、碱性磷酸酶等的检测结果产生负干扰。

2.4 通过影响检测过程的反应条件

基于PCR类技术的检测试剂，检测过程依赖于Taq聚合酶的活性进行聚合酶链反应，而样本中添加抗凝剂肝素，会直接抑制聚合酶的活性[4]，影响整个检测系统中的反应条件，从而影响检测结果的准确度。

综上，原则上所选择的抗凝剂带有的离子不应与检测离子相同，检测结果会直接受抗凝剂本身离子影响而造成结果的偏差。其次是避免抗凝剂直接与试剂组分中的物质反应，影响产品的反应体系。另外，所选择的抗凝剂也不应影响被测物酶的活性，或者干扰血液成分的浓度、形态分布和产生聚集效应等。

3.体外诊断试剂注册审评过程对抗凝剂的干扰研究资料要求

根据二类体外诊断试剂注册审评要求，体外诊断试剂申请人可通过两种途径进行抗凝剂的干扰评估：一是在产品分析性能评估过程中参照相关干扰研究标准和指南文件，选择人源性样本进行干扰试验研究。研究方案、研究数据及研究评估报告等将作为国家总局发布的《关于公布体外体外诊断注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（2014年第44号）中第六项分析性能评估资料的要求来进行提交；二是在临床试验过程一并进行研究，确定抗凝剂是否适用于相应的样本类型和申报产品的检测系统中。

此外，抗凝剂干扰研究结果应在产品说明书中明确，提醒用户检测的样本应添加何种抗凝剂或不宜添加何种抗凝剂。比如可在产品说明书中样本的要求内容中明确该产品仅适用于添加EDTA、肝素、枸橼酸钠的血浆样本。

3.1 在分析性能评估中对抗凝剂的干扰研究及结果分析

抗凝剂作为一种外源性干扰物质，注册申请人在产品分析性能评估中样本的处理可参考EP7-A2指南文件[5]，评估方法和结果分析可参考EP9-A2指南文件[6]，通过对比研究，从而得出添加抗凝剂的待评价系统与参考系统的检测结果是否具有可比性。

3.1.1 研究方法

研究过程首先评估试剂的检测样本可用于何种样本，若检测项目可同时用于血清及血浆、全血样本的，可通过申报试剂对至少40例同源的人血清样本及加入要评估的抗凝剂血浆或全血样本进行对比研究，来验证两样本测定结果的一致性；若检测项目只能用于全血单一样本的（如糖化血红蛋白），可参考EP9-A2指南文件，选用质量较好的已上市试剂为参考系统，用申报试剂的检测结果为待评价系统，分别对40例添加相同抗凝剂的样本进行检测。通过方法比对，来证明两者的差异不具有统计学意义。另外需要注意的是样本选择的浓度范围尽可能涵盖医学决定水平，并均匀分布。而抗凝剂添加的干扰浓度应依据临床经验的用量、参考相关临床文献和依据全国临床检验操作规程提供的浓度等。

3.1.2 结果处理及数据分析

基于上述方法的检测结果，首先需要对数据进行分析，数据的剔除和纳入统计原则可参考EP9-A2指南文件中的相关要求。结果的统计一般以申报产品对血清样本的检测结果(上市试剂对添加待评估抗凝剂的检测结果）为x轴，添加抗凝剂血浆或全血样本的检测结果（申报试剂添加加待评估抗凝剂的检测结果）为y轴，绘制散点图并进行直线回归分析，得出拟合方程y=a+bx，计算a、b的95%置信区间（或99%置信区间），确定斜率b和截距a是否具有统计学意义，同时对相关系数r进行假设性检验，确定概率P值，确定两者直线相关是否成立。

除了上述结果的相关性分析外，还应进行定量的一致性分析。参考EP9-A2指南，首先找到相应检测项目的医学决定水平，根据得出的回归方程y=a+bx，计算在给定的医学决定水平Xc处的预期偏倚（Bc）的估计值，即。另外根据公式求出预期偏倚的95%置信区间[6]。如果预期偏倚的可信区间包含了规定的可接受偏倚（通常以CLIA’88对室间评估的允许误差的1/2为规定的可接受偏倚），或如果可接受偏倚大于预期偏倚可信区间的上限，则认为两者的测定结果具有可比性。

3.2 临床试验过程对抗凝剂的干扰研究及结果分析

临床试验过程对抗凝剂的干扰研究主要依据《体外诊断试剂注册管理办法》《体外诊断试剂临床试验指导原则》等法规对二类体外诊断试剂临床试验的要求。

3.2.1 研究方法

样本添加抗凝剂后对检测结果的干扰评估在临床试验过程可以分为两种情况：一是当体外诊断试剂明确适用的样本类型同时有血清、血浆/全血的情况时，应当在至少2家获得国家食品药品监督管理总局认可的临床试验机构，对200例以上临床样本采用申报试剂与对比试剂进行方法学比对及偏倚评估。在此基础上，再用申报试剂对至少100例在同一受试者添加了待评估的抗凝剂血浆/全血中（若要评估多种抗凝剂，应分别选用至少100例）进行检测，其结果直接与血清样本结果进行相关性及一致性分析。二是当体外诊断试剂明确适用的样本类型无血清样本时，则需要通过至少2家临床试验机构，采用申报试剂与对比试剂，分别对200例以上的添加抗凝剂后样本血浆/全血样本进行检测，同样对双份检测结果进行对比分析。另外应注意申报试剂的临床样本类型和抗凝剂的类型应不超过对比试剂说明书中的样本和添加的抗凝剂类型。

3.2.2 结果处理及数据分析

该部分的结果处理和数据分析方法直接参考3.1.2内容。因临床试验过程对试验结果的统计分析方法较多，注册申请人也可根据实际的检测结果的数据分布规律选择适用的统计方法，检测结果应进行相关性及一致性分析。当结果服从正态分布且方差齐性时，采用Pearson进行线性相关分析，而一致性分析可采用t检验、Bland-Altman分析等；当结果为非正态分布时，相关性采用Spearman秩相关分析，一致性则可采用秩和检验。另外，对分别单独添加了不同抗凝剂（评估的抗凝剂种类较多时）的样本进行检测，得到多组数据的结果时，建议采用多组数据进行方差分析，可采用SPSS、SAS等软件进行检验，若总体组间存在差异可进一步进行两两比较，来判断所有抗凝剂检测结果组间差异是否具有统计学意义。

申请人可根据实际情况选择上述合适评估抗凝剂对检测结果影响的研究方法，也可用其他的方法进行研究，但应有科学可靠的来源依据，并建立该抗凝剂是否干扰检测结果的评价及接受标准。最后，研究结果应能证明添加了待评价抗凝剂的样本不影响临床结果的决定。

[1] 国家食品药品监督管理总局. 体外诊断试剂注册管理办法(国家食品药品监督管理总局令第5号)[Z]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0053 /103757.html, 2014.

[2] 尚红, 王毓三, 申子瑜, 等. 全国临床检验操作规程[M]. 第4版. 人民卫生出版社, 2015.

[3] 全德胜, 杨静, 沈国强. 抗凝剂EDTA导致血小板假性减少现象的分析[J]. 实验与检验医学, 2015,33(1):102-103.

[4] 李霞莲, 苗晋华. 抗凝剂对实验室检查结果的影响[J]. 实用医技杂志, 2015,22(6):620-621.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute. Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline-Second Edition. [S]. EP7-A2,CLSI, 2005.

[6] The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline—Second Edition. [S]. EP9-A2,NCCLS, 2002.

Infuences of Anticoagulant on Detecting Results of IVD Use and Its Interference Studying Methods

LIANG Chun-ying LI Xiao-jiang Center for certifcation and evaluation, GDFDA (Guangdong Guangzhou 510080)

When the intended use of IVD clearly types that its testing clinical samples is plasma or whole blood, the applicant should clearly defnite the anticoagulant in the registered description and provide the interference studying results of anticoagulant. This paper mainly bases on the mechanism of clinical commonly used anticoagulants, the infuence factors of anticoagulant on detecting results of in vitro diagnostic reagents used, etc, combining with the regulations for the administration of IVD registration, and other regulations requirements, to explore the studying methods of anticoagulant interfering with IVD testing process during its studying and clinical trial period.

anticoagulant, technical review of in vitro diagnostic reagents registration, factors of infuence, interference studying methods

1006-6586(2016)11-0001-03

R197.39

A

梁春滢，助理工程师，广东省食品药品监督管理局审评认证中心医疗器械审评员；李小江，工程师，中级职称，医疗器械审评员