红树植物秋茄类黄酮代谢及其抗氧化活性对高盐胁迫的响应

宋晓敏，吕晓杰，邱智敏，邢建宏，陈世品，谭芳林，陈 伟*



红树植物秋茄类黄酮代谢及其抗氧化活性对高盐胁迫的响应

宋晓敏1，吕晓杰1，邱智敏3，邢建宏4，陈世品3，谭芳林2，陈 伟1*

(1 福建农林大学 生命科学学院，福州 350002；2 福建林业科学研究院，福州 350012；3 福建农林大学 林学院，福州 350002；4 三明学院 资源与化工学院，福建三明 365004)

以红树植物秋茄为试验材料，设置不同浓度NaCl(0、200和500 mmol·L-1)处理的砂培实验，应用qRT-PCR分析秋茄叶片中类黄酮物质合成上游的4个关键酶基因——苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、肉桂酸羟化酶基因(C4H)、4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)和查尔酮合成酶基因(CHS)的转录水平，并对关键酶活性进行了分析，同时测定了幼苗生物量、钾钠离子含量、类黄酮含量及其抗氧化活性，以探讨秋茄耐盐性与类黄酮物质的关系，为揭示木本植物耐盐机制奠定基础。结果显示：(1)在盐处理条件下，秋茄叶片中PAL、4CL、C4H和CHS4个关键酶基因的转录水平显著上调，PAL、4CL、C4H酶活性和CHS含量随着盐浓度的增加而明显上升。(2)与对照相比，秋茄根、茎、叶干重在盐处理3 d和15 d后均无显著变化，而秋茄株高仅在200 mmol·L-1盐处理15 d后显著增加，其余浓度和时间均未发现有显著性变化。(3)随着盐浓度的升高，秋茄叶片类黄酮含量显著增加，K+/Na+明显下降，丙二醛含量显著降低，活性氧自由基清除率显著增加。研究表明，盐处理加强了秋茄叶片中类黄酮代谢过程中相关酶基因的表达，类黄酮物质的累积有助于其抗氧化能力的提高，进而提高秋茄的抗盐性，维持盐胁迫下秋茄的正常生长。

秋茄；盐胁迫；类黄酮代谢；抗氧化；qRT-PCR

土壤盐碱化是影响全世界农业生产和生态环境最主要的非生物胁迫因子之一。目前，全世界的盐碱土地超过10亿公顷，占陆地总面积的30%；中国大约有3 600 hm2的盐渍地，占总耕地面积的6.62%[1]。土壤中高浓度的盐分对植株的伤害主要表现在离子毒害、渗透胁迫、营养缺乏等方面，受到盐胁迫的作物生长受到限制，甚至会死亡[2-3]。植物一般通过抗氧化酶和抗氧化物质体系来抵御逆境胁迫，同时，也可通过积累次生代谢物质(如类黄酮、花青素等)来清除活性氧(ROS)，起到保护植物体的作用[4]。类黄酮等次生代谢物质在植物防御逆境过程中起重要作用[5-6]，其中最显著的作用是参与逆境胁迫下植物的解毒抗氧化和ROS清除。高晓辉等[7]研究表明，梨(PyrusbretschneideriRehd. cv. Pingguoli)果实在苹果酸处理下，其体内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性显著增加，同时相关次生代谢产物类黄酮含量也提高。

秋茄[Kandeliacandel(L.) Druce]属红树科秋茄树属植物，是一种典型的非泌盐红树植物，分布于热带、亚热带陆海交汇处，在中国主要分布于海南、广西、广东、台湾、福建、香港的海湾，对维护海岸生态平衡有重要作用[8]。此外，秋茄是一种盐生木本植物，生活于海水浸渍的较高盐度的泥滩中，经长期进化形成了一套木本植物特有的耐盐机制，因此秋茄体内蕴含着丰富的抗逆基因资源，挖掘其耐盐基因具有重要的应用价值。目前，前人对植物的盐响应机制的研究主要集中在植株生长和生理特性的变化方面。例如，在盐胁迫处理下，烤烟(flue-cured tobacco)叶片中的苯丙氨酸解氨酶活性和类黄酮含量明显增加[9]；紫叶李(Prunuscerasiferavar.atropurea)在盐胁迫下叶色逐渐转绿，叶绿素、花青苷、类黄酮含量呈先上升后下降的趋势[10]。但是，红树植物耐盐性与类黄酮代谢的关系研究还鲜见报道。本实验室(福建农林大学生命科学学院)应用RNA-Seq技术对秋茄转录组进行了研究，结果发现盐胁迫下秋茄叶片中类黄酮代谢途径相关基因表达变化显著[11]。本研究以此为切入点，应用qRT-PCR技术进一步分析秋茄叶片类黄酮代谢途径中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)和查尔酮合成酶(CHS)4个关键酶基因的转录水平，并测定了类黄酮含量及其抗氧化活性，探讨秋茄耐盐性与类黄酮物质的关系，为进一步揭示木本植物耐盐机制提供有价值信息，同时也为今后应用转基因技术将红树植物耐盐相关基因转入主要作物，培育耐盐植物奠定相关的分子生物学基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用成熟的秋茄胚轴采自福建泉州洛阳河红树林保护区，经纬度分别为24°58′N和118°39′E，海水盐度为8‰～20‰。选择外观完好、无虫害、大小相近的胚轴培养于洁净的砂子中，每盆(30 cm× 42 cm× 14 cm)种植10～15株，每隔2 d每盆浇灌1 L Hoagland营养液，平时补充水分。待秋茄幼苗第二对叶片完全展开时，对幼苗进行盐胁迫处理，以Hoagland营养液为基本溶液，添加NaCl配制适宜浓度(200 mmol·L-1NaCl)和高浓度(500 mmol·L-1NaCl)盐胁迫处理液，以无添加NaCl为对照组，处理3 d后取叶片样品，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。每个处理设3个生物学重复。

表1 qRT-PCR分析的引物列表

1.2 秋茄叶片C4H、4CL、PAL和CHS基因表达的qRT-PCR验证

采用CTAB-LiCl沉淀法[12]提取叶片总RNA后，参照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time；TaKaRa公司，日本)产品使用说明书，将秋茄叶片总RNA反转录合成cDNA第一链。获得的cDNA产物于-20 ℃贮藏备用。根据秋茄的转录组数据，应用PrimerPremier 5.0软件设计目的基因的Real-time PCR引物(表1)。qRT-PCR按照荧光定量试剂盒SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司，日本)说明书在ABI 7500 PCR仪进行分析。qRT-PCR反应体系为：2×SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)5.0 μL，Primer-S(10 μmol·L-1)0.2 μL，Primer-A(10 μmol·L-1)0.2 μL，cDNA模板0.5 μL，DNase Free ddH2O补足至10 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环；65 ℃升至95 ℃，每升高0.5 ℃，恒温保持5 s，期间进行荧光信号采集。选择Actin作为内参基因。基因相对表达量采用2-ΔΔCt法[13]进行计算。每个试验设3个重复。

1.3 生理指标测定

1.3.1 秋茄幼苗生物量 在盐处理3和15 d后分别采集10株幼苗进行生物量的测定，株高采用直尺测定从根部到第一个茎叶分叉端的高度[14]，根、茎、叶干重参照陈颖等[15]方法。

1.3.2 秋茄叶片PAL、C4H、4CL活性及CHS含量 PAL活性参照陈雷等[16]方法，以每分钟OD290值变化0.01定义为一个酶活单位(U),酶活性用U·mg-1表示。C4H活性参照Lamb等[17]方法，以每分钟OD340值变化0.01定义为一个酶活单位(U),酶活性用U·mg-1表示。4CL活性参考范存斐等[18]方法，以每分钟OD333值变化0.01定义为一个酶活单位(U),酶活性用U·mg-1表示。CHS含量测定参考植物CHS酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)操作步骤进行：称取0.5 g叶片，加入3 mL磷酸缓冲液(pH 7.5)，低温下迅速研磨成匀浆，静置30 min后4 ℃、15 000 g离心10 min，上清液为CHS粗酶液；接着在酶标板中加入30 μL样品稀释液和20 μL CHS粗酶液，37 ℃温育30 min，弃去液体，甩干后每孔加满洗涤液，静置30 s，弃去，重复5次，将酶标板倒扣在滤纸上拍干后，加入50 μL酶标试剂，37 ℃温育30 min，每孔加满洗涤液洗涤5次后拍干，然后加入显色剂A、B各50 μL，37 ℃避光显色10 min，最后加入50 μL终止液终止反应，在450 nm下测定吸光值。先用标准品制作标准曲线，再通过标准曲线计算CHS含量。所有酶活性测定均采用蛋白含量进行计算，蛋白含量按照Bradford方法[19]测定，以BSA为标准蛋白。

1.3.3 秋茄叶片钾钠离子含量、类黄酮含量及其抗氧化活性 叶片中钾、钠离子含量的测定采用火焰分光光度法[20]。类黄酮含量参考赵亚婷等[21]方法，丙二醛(MDA)含量参照李合生[22]方法，羟自由基清除率参照郭亚力[23]方法，超氧离子自由基清除率参照贾之慎等[24]方法。

1.4 数据分析

所有试验数据均以平均值 ± 标准差表示，每个实验均进行3次生物学重复，用SPSS 18.0软件对试验数据进行统计分析，P< 0.05为显著差异水平。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下秋茄叶片C4H、4CL、PAL和CHS基因表达分析

C4H、4CL、PAL和CHS是类黄酮代谢途径的关键酶。与对照组相比，秋茄叶片中PAL、C4H、4CL和CHS基因表达水平均随着NaCl处理浓度的增加而显著提高(P< 0.05)，且盐处理间大多差异显著(图1)。其中，秋茄叶片中PAL基因表达水平在200 和500 mmol·L-1NaCl处理下分别比对照显著提高了1.5和2.3倍，C4H基因表达水平分别显著提高了1.0和0.8倍，4CL基因表达水平分别显著提高了2.0和3.0倍，而CHS表达水平分别比对照显著提高了1.0和3.25倍。

2.2 盐胁迫下秋茄叶片PAL、C4H、4CL酶活性和CHS含量分析

在适宜浓度(200 mmol·L-1)和高浓度(500 mmol·L-1)盐胁迫处理下，秋茄叶片中PAL、C4H、4CL和CHS 活性均比对照不同程度提高，且除适宜浓度盐处理的PAL活性外均达到显著水平(P< 0.05)，并以高浓度盐胁迫处理显著高于适宜浓度盐胁迫处理(图2)。其中，与对照相比较，200 和500 mmol·L-1处理秋茄叶片中PAL活性分别上升了1%和 80%(图2，A)，C4H活性分别显著提高了30%与63%(图2，B)，4CL活性分别显著提高了7%和39%(图2，C)，类黄酮物质合成关键酶CHS含量分别显著提高了33%和92%(图2，D)。

2.3 盐胁迫下秋茄钾钠离子含量、类黄酮含量及其抗氧化活性分析

与对照相比，秋茄叶片类黄酮含量随着盐胁迫浓度的上升而提高，其在200和 500 mmol·L-1NaCl处理下分别上升了6%和 26%，但仅500 mmol·L-1NaCl处理达到显著水平(图3，A)。同时，秋茄叶片MDA含量在盐胁迫下比对照显著降低(P< 0.05)，并有随着盐浓度的上升而下降的趋势，200 和500 mmol·L-1NaCl处理叶片中MDA含量分别比对照显著下降了38%和 46%，但两盐胁迫处理间无显著差异(图3，B)。同叶片MDA含量相呼应，与对照组相比，秋茄叶片中羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率在盐胁迫下均显著上升(P< 0.05)，200 和500 mmol·L-1NaCl处理的羟自由基清除率升幅分别为39%和45%，而它们相应的超氧阴离子自由基清除率升幅分别为27%和37%，但两盐胁迫处理间无显著差异(图3，C、D)。另外，在盐胁迫条件下，秋茄叶片K+含量与对照组相比没有显著变化(P> 0.05)，而叶片中Na+含量随着盐浓度的提高而显著上升(P< 0.05)，200 和500 mmol·L-1NaCl处理的Na+含量分别比对照组显著上升了9%和31%，从而导致叶片中K+/Na+随着盐浓度的升高而显著降低，且高盐处理降低幅度更大(图3，E、F)。

不同小写字母表示同一基因不同处理间差异显著(P<0.05)图1 盐胁迫下秋茄叶片类黄酮代谢途径相关差异基因的qRT-PCR分析The different normal letters mean significant differenre at differente treatments with the same gene (P<0.05)Fig.1 qRT-PCR analyses of differential expression genes of flavonoid metabolism in K.candel under salt stress

不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05),下同图2 盐胁迫对秋茄叶片PAL、C4H、4CL活性和CHS含量的影响The different normal letters mean significant difference among treatments at 0.05 level, the same as Fig.3Fig.2 Effect of salinity on the activities of PAL, C4H, 4CL and CHS content in K. candel leaves

图3 盐胁迫对秋茄叶片钾钠离子含量、类黄酮含量及其抗氧化活性的影响Fig.3 Effect of salinity on the contents of K+, Na+ and flavonoids and the antioxidant activity in K. candel leaves

培养天数Cultivationtime/dNaCl浓度NaClconcentration/(mmol·L-1)株高Height/cm每株干重Dryweight/g叶Leaf根Root茎Stem3036．8±2．1a0．2506±0．0313a0．3272±0．0396a0．2186±0．0253a20038．1±1．9a0．2718±0．0320a0．3508±0．0309a0．2328±0．0237a50035．9±2．3a0．2361±0．0316a0．3102±0．0325a0．2106±0．0229a15040．2±2．2b0．2984±0．0274ab0．3596±0．0368ab0．2502±0．0262ab20043．9±2．1a0．3269±0．0257a0．3955±0．0402a0．2788±0．0284a50037．5±2．5b0．2804±0．0294b0．3318±0．0352b0．2214±0．0243b

注：同列不同字母表示处理间在 0.05水平上达到显著性差异(P<0.05)

Note： Different letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level

2.4 盐胁迫下秋茄生物量分析

植物生物量是反映盐胁迫伤害程度的最直观准确指标。表2显示，与对照组相比，在各浓度盐胁迫处理3 d后，秋茄的株高以及根、茎、叶干重均未发生显著性变化。在盐处理15 d后，秋茄的株高在200 mmol·L-1NaCl处理下显著高于对照组(P< 0.05)，在500 mmol·L-1NaCl处理下则稍低于对照组但差异不显著，而同期秋茄的根、茎、叶干重在200 和500 mmol·L-1NaCl 处理下均与对照组无显著性差异。可见，在本实验设置的处理浓度和处理时间下，秋茄植株生长没有受到盐胁迫显著抑制，表现出较强的耐盐胁迫能力。

3 讨 论

众所周知，植物体内类黄酮代谢中物质合成起始于苯丙氨酸，通过PAL、C4H和4CL 3个关键酶的作用下再由苯丙氨酸生成4-香豆酰CoA，4-香豆酰CoA在CHS的作用下形成查尔酮，因此CHS也是类黄酮物质合成途径的限速酶[25]。本研究结果显示，盐胁迫提高了秋茄叶片中PAL、C4H、4CL和CHS基因的转录水平，同时增强了秋茄叶片PAL、C4H、4CL活性和增加了CHS含量。PAL存在于植物和微生物中，能够应答干旱、UV-B辐射、植物激素和稀土元素等多种胁迫诱导[25-26]。杨晨等[14]以姜黄(Curcumaaromatica)组培苗为试验材料，分别以不同浓度NaCl进行盐胁迫处理，发现在50～100 mmol·L-1NaCl胁迫下，PAL活性显著提高；陈颖等[15]发现在4～8 d内，在适度盐浓度处理下，银杏(GinkgobilobaL.)细胞内PAL活性随着盐浓度的提高而增强，且NaCl浓度越高，酶活性越强。本研究结果与他们相一致。C4H活性可以影响类黄酮和木质素的合成等多条代谢支路。闫丽等[27]报道，高粱[(Sorghumbicolor(L.) Moench)]中C4H活性直接影响木质素的合成；陈鸿翰等[28]发现苦荞(Fagopyrumtataricum)在UV-B胁迫下类黄酮含量与FtC4H基因表达量呈正相关关系。4CL是类黄酮代谢主要途径向分支途径转折的一个关键酶，在植物与环境相互作用中起到了一个关键作用。有研究表明，UV-B处理可提高植物4CL活性，促进次生代谢物质的生成，进一步增强植株的抗氧化能力[29]。CHS为类黄酮提供基本的碳架结构，为类黄酮、花青素合成提供保障。CHS是合成类黄酮物质的关键酶，而其本身又在植物的抗胁迫、花色素的积累、类黄酮物质合成以及外源基因的表达等方面起着重要的作用[30]。本研究发现CHS含量随着盐浓度的升高而增加，这意味着盐处理下CHS含量的增加有助于秋茄叶片中类黄酮、花青素等次生代谢物质的合成。

近年来，大量研究表明由类黄酮代谢途径产生的多种次生代谢物质在植株生长发育、抵抗虫害及构成植物细胞壁等方面具有重要意义[21]。本研究发现盐胁迫15 d后，500 mmol·L-1NaCl处理下的秋茄株高、根茎叶干重与对照组相比均无显著性差异，这说明高盐胁迫并没有抑制秋茄生长。此外，植物在适应逆境环境会产生各种次生代谢物，包括类黄酮物质，而且生物类黄酮具有极强的抗氧化和抗自由基能力[31]。在环境胁迫条件下，植物通过增加植物体内类黄酮化合物来防御环境胁迫，类黄酮是植物综合防御体系的一部分，具有一定清除氧自由基的作用，能降低逆境胁迫对植株细胞的损伤，对细胞具有防护功能。王改利等[32]发现适宜干旱胁迫能诱导酸枣[(ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chow)]叶片中类黄酮含量显著增加。同时，红砂(Reaumuriasoongorica)类黄酮含量在UV-B辐射下也显著增加，抗氧化能力增加，有效减轻了辐射胁迫对植株造成的氧化损伤[33]。一般在盐胁迫条件下，非盐生植物体内离子平衡被打破，K+含量降低，Na+含量积累[20]。而在本研究中，盐生植物秋茄叶片K+含量在盐胁迫下没有显著性变化，Na+含量升高，K+/Na+降低，这说明秋茄调节离子平衡的能力较强。MDA是膜脂过氧化的产物，其含量的高低反映了细胞膜脂过氧化的程度和植株受逆境伤害的程度。然而，秋茄叶片膜脂系统在高盐胁迫下并没有遭到破坏，反而得以加强，并且抗氧化能力与类黄酮含量呈正相关。这与前人的研究报道相一致[32,33]。

综上所述，盐胁迫能诱导秋茄叶片PAL、C4H、4CL和CHS基因表达水平显著上调，促进PAL、C4H、4CL活性和CHS含量显著提高，引起相关次生代谢产物类黄酮含量的显著增加以及叶片膜脂过氧化程度的降低和K+/Na+降低，导致活性氧自由基的清除率显著提高，从而使得秋茄生物量在盐胁迫下基本没有受到显著抑制。这些结果都说明类黄酮代谢途径的加强与秋茄抗氧化活性和渗透调节的增强密切相关，红树植物秋茄通过调控类黄酮代谢来适应高盐环境是其耐盐性的一个重要特性。

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(编辑:裴阿卫)

Flavonoid Metabolism and Antioxidant Activity in Response to Salt Stress in MangroveKandeliacandel

SONG Xiaomin1, LÜ Xiaojie1, QIU Zhimin3，XING Jianhong4,CHEN Shipin3，TAN Fanglin2，CHEN Wei1*

(1 College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2 Fujian Academy of Forestry, Fuzhou 350012, China; 3 College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4 College of Resources and Chemical Engineering, Sanming University, Sanming, Fujian 365004, China)

In the present study, mangroveKandeliacandel(L.) Druce were potted in sand and treated with different NaCl concentrations (0, 200 and 500 mmol·L-1).The relative expression of four key genes in the flavonoid metabolism, phenylalanine ammonia lyase (PAL), cinnamic acid hydroxylase (C4H), 4-p-coumaric acyl coenzyme A ligase (4CL) and chalcone synthase(CHS) were analyzed in response to salt stress by quantificational Real-time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). In addition, the biomass, K+and Na+contents, the activities of key enzymes, the contents of flavonoid and the antioxidant activity in response to salt ofK.candelwere investigated. Our results showed that: (1) the expression levels ofPAL, 4CL,C4HandCHSwere up-regulated significantly under salt conditions; the activities of PAL, 4CL and C4H as well as CHS content were increased significantly with salt concentration increasing; compared with the control. (2) The plant height as well as the dry weight of leaf, root and stem were not changed significantly in NaCl treatment for 3 d and 15 d except the plant height significantly changed in 200 mmol·L-1NaCl treatment for 15 d. (3) The content of flavonoid, and the scavenging rate of hydroxyl radical and superoxide free radical were increased, the K+/Na+ratio and the content of MDA were decreased significantly. These results indicate that the flavonoid metabolism inK.candelunder salt conditions can be enhanced and may play an important role in the adaption to the saline environment. Accumulation of flavonoids contributes to oxidation resistance and salt tolerance ofK.candelin order to maintain plant growth under salt conditions.

Kandeliacandel; salt stress; flavonoid metabolism; antioxidant; qRT-PCR

1000-4025(2016)12-2461-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2461

2016-07-31;修改稿收到日期:2016-12-12

林业公益性行业科研专项经费(201504415)；福建省自然科学基金(2014J01137)

宋晓敏(1992-)，女，硕士，主要从事植物生理与分子生物学研究。E-mail:18750193499@163.com

*通信作者:陈 伟，博士，教授，博士生导师，主要从事植物生理与分子生物学研究。E-mail: weichen909@163.com

Q945.78

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