opaque-2基因对爆裂玉米籽粒性状、品质和膨爆特性的影响

周 强，史庆玲，董永彬，李彦伟，邓 飞，马智艳，乔大河，李玉玲

(河南农业大学 农学院/河南粮食作物协同创新中心/小麦玉米作物学国家重点实验室，河南 郑州450002)

opaque-2基因对爆裂玉米籽粒性状、品质和膨爆特性的影响

周 强，史庆玲，董永彬*，李彦伟，邓 飞，马智艳，乔大河，李玉玲*

(河南农业大学 农学院/河南粮食作物协同创新中心/小麦玉米作物学国家重点实验室，河南 郑州450002)

采用分子标记辅助选择技术将opaque-2(o2)基因导入到2个爆裂玉米自交系中，分析了o2基因对爆裂玉米籽粒性状、品质及膨爆特性的影响。结果表明，利用分子标记辅助选择可以高效地将o2基因导入到爆裂玉米自交系；在BC3F2群体中o2爆裂玉米籽粒的粗蛋白含量比野生型降低0.34%～3.97%，百粒膨化体积比野生型减少17.50～96.50 mL；爆花率比野生型降低25.00%～98.00%；膨化倍数比野生型减少1.50～10.24 mL/g；而o2基因对爆裂玉米其他性状影响较小。因此，o2基因对爆裂玉米籽粒的粗蛋白含量和膨爆特性影响较大。

爆裂玉米；opaque-2 基因； 籽粒性状； 品质； 膨爆特性

opaque-2(o2)基因是玉米胚乳发育中重要的转录因子，该基因发生突变可导致玉米胚乳中氨基酸构成和蛋白质组成发生变化，使玉米胚乳中赖氨酸、色氨酸含量显著增加[1-3]。因此，可以利用回交转育法将o2基因导入到玉米自交系，创制高赖氨酸含量玉米种质[4-5]。但含有o2基因的玉米种质一般会表现出胚乳质地松软、容重低、籽粒品质差等缺陷[6-7]。前人研究发现，在玉米胚乳中存在o2修饰基因，在不同遗传背景中o2修饰基因能够不同程度地提高玉米胚乳的硬质度，利用o2修饰基因是克服o2玉米缺陷的主要途径之一[8-12]。

爆裂玉米是一种专门用于制作玉米膨化食品的特种玉米，在常压条件下加热可以爆裂膨化至原体积的几倍甚至几十倍[13-14]。膨爆特性是决定爆裂玉米利用价值的关键指标，但受品种本身特性和加工条件诸多因素的影响[15-18]。膨爆特性与籽粒性状、胚乳结构和成分均存在一定的相关性。爆裂玉米的胚乳几乎都是由角质淀粉构成的，质地坚硬，角质胚乳越多，膨爆能力就越强[13-15,19]。但玉米籽粒蛋白质一般缺乏赖氨酸和色氨酸，从而影响了其营养品质。因此，本研究利用分子标记辅助选择技术将普通玉米o2基因导入到爆裂玉米自交系中，探讨了o2基因对爆裂玉米籽粒性状、品质和膨爆特性的影响，以期为爆裂玉米改良提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为野生型O2爆裂玉米自交系N10、N04，o2普通玉米自交系。

1.2o2基因回交导入系构建

利用分子标记辅助选择结合回交转育技术将o2基因分别导入爆裂玉米自交系N04、N10。首先是亲本材料杂交；然后将F1与轮回亲本进行回交获得BC1F1，从回交后代中利用分子标记筛选目标单株，从中选择含有目的基因且综合性状好的植株与轮回亲本连续回交；然后选择包含目的基因且农艺性状优良的植株进行自交纯化(图1)。

图1 o2基因回交导入爆裂玉米的过程

1.3 田间试验种植和性状调查

2014年夏在郑州古荥种植o2近等基因系BC3F2家系和亲本，试验地排灌设施良好，肥力中等。2行区，行长4 m，行距0.6 m，株距0.22 m。栽培管理同一般大田。玉米6～7叶时单株挂牌取样。生理成熟后单株收获。

自交或姊妹交果穗自然晒干后逐穗考种，考察粒长、粒宽、粒厚、百粒质量、百粒体积等性状。每小区随机取无病虫的完整籽粒，利用8620型Bruker FT-NIR近红外光谱分析仪测定粗淀粉含量、粗蛋白含量、粗脂肪含量和赖氨酸含量。

1.4 DNA提取和标记检测

1.4.1 PCR引物o2-1 R：5′-CTCCCTGAAG-CGGGTGATAGA-3′；o2-1 F：5′-ACCGTTGCCG-ACCGAAGC-3′。

1.4.2 样品DNA提取 ①将样品磨碎；②加入SLS缓冲液850 μL，破裂DNA；③在上述反应液中加入酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)850 μL；④将反应液混合均匀后13 000 r/min离心5 min；⑤抽取上清液600 μL加入异丙醇400 μL冰浴1 h，13 000 r/min离心10 min；⑥倒掉上清，加入75%乙醇1 000 μL进行洗涤，静置过夜；⑦倒掉乙醇，晾干后加入ddH2O溶解。

1.4.3 PCR反应体系 包括2× Pfu buffer 12.5 μL，Pfu酶0.5 μL，灭菌水9 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，提取样品DNA 1 μL，共25 μL。

1.4.4 PCR反应程序 95 ℃预变性4 min；95 ℃变性45 s，57 ℃复性45 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4.5 琼脂糖凝胶电泳 ①称取2 g琼脂放入干净锥形瓶，加入200 mL蒸馏水溶解；②待温度降到50 ℃左右时倒胶，然后放入梳子；③等待胶板冷却凝固，将其放入电泳槽(电泳缓冲液没过胶板)进行点样；④点样结束后电泳30 min；⑤用DNA凝胶成像系统显色成像。

1.5 CAPS标记开发

利用o2-1引物扩增含o2普通玉米和野生型爆裂玉米自交系N04、N10，PCR产物送到北京六合华大基因科技股份有限公司测序。根据测序结果开发了1个CAPS标记，该标记利用限制性内切酶SmlⅠ酶切PCR扩增产物。PCR产物酶切体系(20 μL)：10× buffer 2 μL、SmlⅠ酶1 μL、灭菌水12 μL、PCR产物5 μL。55 ℃酶切2 h，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用DNA凝胶成像系统显色成像。

1.6 样品扫描电镜观察

取成熟期玉米籽粒，用刀片将籽粒胚乳背部横切2次，让其自然断开，去掉两端，留取中部胚乳为观察样本。将观察样本的一个截面用胶带纸粘贴，置于载物台上，在IB-3型离子溅射仪内对样品断裂面喷金后，用Philips XL30-ESEM扫描电镜观察淀粉粒形态与结构并照相。

1.7 膨爆特性测试

生理成熟后，按家系收获。果穗自然晒干后，逐穗考种脱粒，以家系为单位混合籽粒。每家系随机数取无病虫的完整籽粒，用电子天平称量粒质量，用BZ-99型豪华爆花机膨化，计数未膨化粒数，由此计算出评价膨爆特性的3个主要指标：百粒膨化体积(mL，以下简称膨化体积)、爆花率(爆花籽粒数/总粒数×100%)和膨化倍数[膨化体积(mL)/百粒质量(g)]。

2 结果与分析

2.1o2基因的CAPS标记开发和利用

利用o2-1引物分别扩增o2普通玉米和野生型O2爆裂玉米自交系N04的DNA，PCR扩增产物送样测序。结果表明，2个爆裂玉米自交系的扩增序列间没有差异，但与普通玉米有多处碱基差异(图2)。根据自交系间序列差异开发了一个功能型CAPS标记，该标记利用限制性内切酶SmlⅠ酶切PCR扩增产物，该酶可以酶切野生型O2爆裂玉米自交系的PCR产物，而不能酶切含有o2普通玉米的PCR产物。因此，利用该标记可以区分出回交后代目标单株是否含有o2基因(图3)。

方框指限制性内切酶SmlⅠ酶切位点图2 o2普通玉米和野生型O2爆裂玉米N04扩增序列比对

1、2、10为O2/O2野生型； 3、4、6、11、12为o2/o2基因型；5、7、9、13为O2/o2基因型； 14、15为亲本基因型；8为DNA分子量标准

2.2o2基因导入爆裂玉米后代表型鉴定

通过标记选择和表型选择相结合将o2基因回交导入到爆裂玉米。在BC3F2家系，含有o2基因家系自交后代的籽粒表现出opaque表型，而不含有o2基因家系自交后代的籽粒表现为野生型表型(图4A)，这与分子标记检测结果相一致。对从BC3F2家系获得的o2爆裂玉米和野生型O2爆裂玉米的籽粒胚乳进行扫描电镜观察，在同样的放大倍数下，淀粉粒大小以及附着蛋白质均有明显不同，野生型O2爆裂玉米淀粉粒较大且附着蛋白质较少，而o2爆裂玉米胚乳淀粉粒变小且附着蛋白质较多(图4B、C)。

A.野生型爆裂玉米(上)和o2爆裂玉米籽粒(下)； B、C分别为野生型爆裂玉米、o2爆裂玉米的胚乳淀粉粒

2.3o2基因对爆裂玉米籽粒性状、品质及膨爆特性的影响

在相同环境条件下，BC3F2群体中o2爆裂玉米籽粒的赖氨酸含量为0.32%～0.40%，与野生型(0.34%～0.39%)相近，个别单株的赖氨酸含量甚至低于野生型(表1)；o2爆裂玉米籽粒的粗蛋白含量(7.71%～9.43%)明显小于野生型(9.77%～11.68%)，降低了0.34～3.97个百分点；而粗淀粉和粗脂肪含量差异较小。o2爆裂玉米与野生型的粒长、粒宽、粒厚、百粒质量、百粒体积等籽粒性状差异也较小。o2爆裂玉米与野生型的膨爆特性差异较大，o2爆裂玉米籽粒的膨化体积变幅为18.50～32.50 mL，而野生型的膨化体积变幅为50.00～115.00 mL，减少了17.50～96.50 mL；o2爆裂玉米的爆花率变幅为0%～28.00%，而野生型的爆花率变幅为53.00%～98.00%，降低了25.00%～98.00%；o2爆裂玉米的膨化倍数变幅为2.16～3.85 mL/g，而野生型的膨化倍数变幅为5.35～12.40 mL/g，减少了1.50～10.24 mL/g(表1)。表明利用分子标记辅助选择可以有效地将o2基因转入到爆裂玉米中，爆裂玉米中导入o2基因对其膨爆特性和粗蛋白含量有较大影响。

表1 BC3F2群体中o2爆裂玉米与野生型及亲本各性状表型

3 结论与讨论

在传统育种中，主要根据表型进行选择，效率低。要提高选择的效率，最理想的方法是能够直接对基因型进行选择[20-21]。分子标记辅助选择不受其他基因效应和环境因素的影响，结果较为可靠，同时可以在低世代及苗期进行分子筛选，有助于加快目标基因的回交导入以及改良现有种质，大大缩短育种年限[4-5,20-21]。本研究根据含有o2基因的普通玉米和野生型爆裂玉米自交系序列差异开发了一个功能型CAPS标记，利用该标记成功地将隐性o2基因导入到2个爆裂玉米自交系中。

o2基因对提高玉米品质具有关键性作用，通过减少醇溶蛋白的合成可以显著提高玉米籽粒中赖氨酸和色氨酸含量[1-3]。本研究表明，o2基因对爆裂玉米的籽粒性状、粗淀粉含量、粗脂肪含量和赖氨酸含量影响较小，而对膨爆特性和粗蛋白含量影响较大，这严重影响了爆裂玉米的膨爆特性。爆裂玉米的膨爆特性与籽粒淀粉等级呈正相关，其胚乳主要是由角质淀粉构成，角质淀粉的比例一般都高于其他类型的玉米，角质胚乳越多，爆裂膨化能力越强[14-19]。但o2爆裂玉米胚乳质地松软，导致爆裂玉米膨爆特性变差。近年来，人们发现了o2基因的修饰基因，利用修饰基因可以改良o2玉米籽粒结构，使籽粒产量、籽粒硬度和农艺性状类似于普通玉米，而赖氨酸和色氨酸含量却明显高于普通玉米[22]。o2修饰基因的发现在一定程度上解决了o2基因对玉米籽粒的不利影响，使o2基因在玉米育种和生产中得到一定的应用[22]。除了o2基因，还有其他基因影响玉米籽粒醇溶蛋白的合成，而且在不同遗传背景下玉米籽粒赖氨酸含量不同[10]。利用ChIP-Seq技术分析o2基因编码蛋白的DNA结合位点，发现了1 143个基因的1 686个DNA结合位点，显示该基因在玉米胚乳发育中具有生物学功能的多效性[23]。因此，需要从分子水平上深入研究o2基因转录激活的结构基因家族的表达调控机制，以期用于改良爆裂玉米的籽粒品质。

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Effect ofopaque-2 Gene on Grain,Quality and Popping Characteristics of Popcorn

ZHOU Qiang,SHI Qingling,DONG Yongbin*,LI Yanwei,DENG Fei,MA Zhiyan, QIAO Dahe,LI Yuling*

(College of Agronomy,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops/National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science,Zhengzhou 450002,China)

In this study,opaque-2 (o2) gene was transferred into two popcorn inbred lines by marker-assisted selection technique,and the effects ofo2 gene on grain,quality and popping characteristics were analyzed in popcorn.The results showed that theo2 gene could be effectively transferred into popcorn inbred lines by marker-assisted selection technique.In the BC3F2population,crude protein content of popcorn witho2 gene was reduced by 0.34%—3.97% compared with that of wild type,popping volume decreased by 17.50—96.50mL,popping rate reduced by 25.00%—98.00%, popping fold decreased by 1.50—10.24 mL/g.But the other traits were less affected byo2 gene.Therefore,the crude protein content and popping characteristics were influenced significantly byo2 gene in popcorn.

popcorn;opaque-2 gene; kernel characteristics; quality; popping characteristics

2015-07-23

基因项目：河南省高等学校重点科研项目(15A210003)；河南农业大学博士科研启动基金项目(30600284)

周 强(1987-)，男，河南罗山人，在读博士研究生，研究方向：玉米遗传育种。E-mail：zhouqiang108056@163.com

*通讯作者：董永彬(1978-)，男，河南商丘人，讲师，博士，主要从事玉米遗传育种研究。E-mail：dyb0816@163.com 李玉玲(1962-)，女，河南舞阳人，教授，博士，主要从事玉米遗传育种研究。E-mail：yuling_li@126.com

S513

A

1004-3268(2016)01-0024-05