菘蓝叶和根的解剖及生物碱的组织化学定位研究

罗晓铮，代丽萍，刘孟奇，陈随清

(河南中医学院 药学院，河南 郑州 450046)

菘蓝叶和根的解剖及生物碱的组织化学定位研究

罗晓铮，代丽萍，刘孟奇*，陈随清

(河南中医学院 药学院，河南 郑州 450046)

为了揭示板蓝根和大青叶外观形状和显微特征与其内在质量的关系，利用光学显微镜和组织化学方法对菘蓝叶和根的显微结构特征以及生物碱类物质在叶和根中的分布情况进行了研究。结果表明:菘蓝叶的上、下表皮上都无毛被; 叶的上、下表皮上都分布有无规则型气孔，下表皮的气孔指数明显高于上表皮的。叶肉有栅栏薄壁组织和海绵薄壁组织之分，栅栏组织有2层细胞。根的韧皮部和木质部间有明显的形成层,韧皮部的薄壁细胞中有大量的淀粉粒。生物碱类化合物在叶中分布在包括栅栏组织和海绵组织在内的一些叶肉细胞中,在根中生物碱类化合物主要分布在韧皮部的一些薄壁细胞中。表明菘蓝根的横切面上韧皮部越宽的质量越佳。

菘蓝; 解剖; 生物碱; 组织化学定位

菘蓝(IsatisindigoticaFort.)是十字花科(Brassicaceae)菘蓝属1年生或2年生草本植物,在全国大多数地区都有栽培。菘蓝的叶和根均可入药，其干燥叶作大青叶入药，干燥根作板蓝根入药[1]。大青叶和板蓝根均味苦，性寒，具有清热解毒、凉血之功效，都是传统的抗病毒中药材，而且板蓝根是公认的具有较好抗病毒效果的少数中药之一[2]。大青叶和板蓝根的重要活性成分主要属于生物碱类化合物(靛蓝、靛玉红和表告依春等)，靛玉红和表告依春的含量分别是大青叶和板蓝根药材及其制剂质量控制的重要指标[1]。板蓝根和大青叶抗病毒疗效显著，市场需求量较大，所以全国各地大量种植菘蓝，然而由于各地区地理条件及栽培管理的不同,导致药材质量存在较大差异。“辨状论质”是中药材鉴定的精髓，为了揭示板蓝根和大青叶外观形状和显微特征与其内在质量的关系，采用徒手切片、组织化学等方法，对菘蓝叶和根的显微结构特征及生物碱的贮藏场所进行研究，旨在为大青叶和板蓝根的生药鉴定和品质评价提供依据，并为菘蓝的合理开发和及时采收提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的叶和根于2014年9月采集于河南中医学院中药植物园(罗晓铮副教授鉴定),分别取成熟植株的主根和叶片。试剂均为分析纯，显微镜为LEICA-DM3000显微镜。

碘-碘化钾(Wagner)试剂：碘1 g与碘化钾10 g溶于50 mL水(微温)，加2 mL乙酸，加水至100 mL。用于生物碱染色，显棕褐色。

改良碘化铋钾试剂(Dragendoff试剂)：(1)碱式硝酸铋0.85 g溶于10 mL冰醋酸与40 mL水中；(2)碘化钾0.8 g溶于20 mL水中。试液(1)与试液(2)等量混合置棕色瓶内保存作贮备液。用前将1 mL贮备液、2 mL冰醋酸与10 mL水混合后，用于生物碱与某些含氮化合物显色反应，显橙红色。

1.2 方法

1.2.1 显微结构观察 叶表皮观察：在叶片中部中脉附近取0.5 cm×1.0 cm的小块，撕去上、下表皮，用水封片。叶和根的徒手切片观察：取新鲜叶片和根，切成小块(段)，用单面刀片对叶和茎进行徒手横切，用水封片。

1.2.2 生物碱组织化学定位 对菘蓝根和叶进行徒手切片，并放置于载玻片上，滴加碘-碘化钾溶液，使切片中生物碱显色，用水封片。对菘蓝的根进行徒手切片后，放置于载玻片上，滴加碘化铋钾溶液，处理10 min，使切片中生物碱显色，用水封片。

以上封片用LEICA-DM3000显微镜观察并照相。

2 结果与分析

2.1 菘蓝叶和根的显微特征

2.1.1 叶的显微特征 叶的上、下表皮均无毛被，上表皮有大量的蜡质颗粒(图 1A)，上、下表皮上均有气孔分布(图 1B，C)，气孔由2个肾形保卫细胞构成，周围一般有3个表皮细胞，无真正的副卫细胞，气孔属无规则型。上表皮气孔大小为(28.5±2.3)μm×(17.6±2.1)μm(长×宽)；下表皮气孔大小为(29.3±2.3)μm×(17.5±2.0)μm，上、下表皮气孔大小相近。下表皮气孔指数为25～30，上表皮气孔指数小，为15～23。上表皮细胞近乎等径，形状无规则，垂周壁呈浅波状弯曲(图 1B)。下表皮细胞较长，形状无规则，垂周壁为深波状弯曲(图 1C)。

A.叶片上表皮,显示有大量的蜡质颗粒；B.叶片上表皮；C.叶片下表皮；D.叶片的横切；E.叶片栅栏组织处的平切；F.叶片海绵组织处的平切；

叶片为异面叶，由表皮、叶肉和叶脉组成。叶片上、下表皮都是单层细胞(图 1D)。从横切面上看，上、下表皮细胞都为方形或长方形，细胞排列紧密，无细胞间隙；上表皮细胞厚度(26±4)μm，下表皮厚度为(22±3)μm，上表皮细胞角质层比下表皮的要厚。叶肉组织厚度为(315±25)μm，有栅栏薄壁组织和海绵薄壁组织之分。栅栏薄壁组织有2层细胞，厚度约(120±20)μm。栅栏薄壁组织邻接上表皮，细胞为短柱状，外层细胞长，内层细胞短。栅栏组织薄壁细胞间有发育良好的细胞间隙(图 1E)，细胞中有很多叶绿体紧贴细胞壁排列成一层。海绵薄壁组织邻接下表皮，由一些等径的薄壁细胞组成，排列疏松，细胞间隙大(图 1F)。和栅栏组织相比，海绵组织厚度大，排列疏松。叶的主脉发达，维管束排列呈半圆形，木质部位于向轴面，韧皮部位于背轴面,维管束鞘明显(图 1G)。在叶主脉维管束鞘的薄壁细胞中发现有淀粉粒(图 1H)。

2.1.2 根的显微特征 从根的横切片(图 1I)观察到韧皮部宽广，射线明显，形成层成环。从纵切片观察到韧皮部薄壁细胞中聚集有大量的淀粉粒,木质部薄壁细胞有少量的淀粉粒(图 1J)。根横切片显示，韧皮部颜色为白色(图 1K)。木质部导管为类圆形，辐射状排列，导管直径约80 μm，导管内有黄色物质(图 1L)。

2.2 菘蓝叶和根的组织化学特征

2.2.1 叶的组织化学特征 碘-碘化钾试剂染色时间不同，可以分别显示生物碱和淀粉粒的存在。在染色时间比较短的时候，显示生物碱。叶横切后或叶片切成小块撕去上、下表皮后，用碘-碘化钾处理后观察，发现在包括叶肉组织(包括栅栏组织和海绵组织)的一些薄壁细胞中有黑色沉淀(图 2A，B)，在对叶片横切的观察中发现主脉的薄壁细胞中也有黑色沉淀(图 2C)，这些黑色沉淀颗粒都比淀粉粒要大得多，显示为生物碱类化合物的分布。如果用碘-碘化钾处理时间稍长，在叶主脉维管束鞘的薄壁细胞中的淀粉粒变成黑色(图 2D)。在叶肉组织细胞中没有发现淀粉粒。

A,B.显示碘-碘化钾处理后叶肉组织中出现黑色沉淀,A为叶横切，B为撕去上下表皮后；C.叶主脉横切片，碘-碘化钾处理后黑色沉淀表

2.2.2 根的组织化学特征 根的横切片用碘-碘化钾处理时间比较短时，发现在韧皮部的一些薄壁细胞有大小不同的黑色颗粒，然而这些颗粒都比淀粉粒要大得多(图 2E，F)，这显示生物碱类化合物的分布；而木质部含有的黑色颗粒较少，因此黑色颗粒主要都集中于韧皮部，由此认为根中生物碱类物质主要分布在韧皮部。为了显示淀粉粒的分布，对根徒手纵切后，用碘-碘化钾溶液染色稍长时间后，水装片观察，可以看到韧皮部的薄壁细胞都含有大量的黑色颗粒，而木质部含有的黑色颗粒较少(图 2G)，对照染色前的淀粉粒分布，发现淀粉粒主要集中在韧皮部中。

由于碘-碘化钾能同时对淀粉粒和生物碱染色，而碘化铋钾试剂只对生物碱染色，为了更好显示生物碱的分布，对根横切后，经过碘化铋钾试剂染色，做水封片观察，发现韧皮部中分布较多橙红色的斑点(图 2H)，而在木质部中只是零星散布(图 2I)，表明生物碱主要分布在韧皮部中。

3 结论与讨论

菘蓝叶上、下表皮均无毛被，上表皮表面有许多小的蜡质颗粒，这种结构可使菘蓝叶表面不易沾水，保持干燥，不容易有真菌繁殖。蜡质层能反射强光，保护植物，这也与上表皮颜色浅有关。菘蓝叶上表皮细胞的外壁有较厚的角质层，可以防止高温下叶片内水分的过度散失；同时可以防止强光对内部细胞的灼伤,保证光合作用的正常进行。菘蓝叶的上、下表皮都分布有无规则型气孔，下表皮的气孔指数显著高于上表皮的，由于叶片下表面的温度要比上表面的低，从而有利于减少水分从气孔的蒸发[3-4]。菘蓝叶表皮的这些结构特点都是对旱生环境的适应，也说明菘蓝是一种阳性植物。

碘-碘化钾组织化学染色表明,菘蓝叶中的生物碱广泛分布在叶肉细胞中，并且主脉的薄壁细胞中也分布有生物碱。对根的组织化学染色表明生物碱类主要分布在韧皮部。对比叶和根的碘-碘化钾染色发现，叶中显色颗粒数目远远多于在根中的，表明叶中生物碱的含量远高于根中。

板蓝根药材断面特征是“金井玉栏”[5]。菘蓝根的显微研究表明，“金井玉栏”与木质部和韧皮部的形态特征相对应。“金井”是因木质部显黄色，推

测可能含有黄酮类成分，有待于进一步研究；“玉栏”指韧皮部为白色，“金井玉栏”是板蓝根药材的断面外观性状的特点。菘蓝根同一产地、相同生长年限的样品木质部与韧皮部宽度比例(木皮比) 差异较大。研究表明[6]，木皮比不同的板蓝根药材质量存在差异，皮部是其活性的主要体现者。对菘蓝根中表告依春含量的研究[7]表明 ，表告依春主要存在于根的韧皮部，表告依春含量的多少与板蓝根药材中的木皮比成反比。本研究表明，菘蓝根中生物碱类物质主要分布在韧皮部，因此木皮比越小，韧皮部面积越大，生物碱分布就越多，因此板蓝根药材的质量就越好。本研究从组织化学方面证实木皮比与板蓝根药材质量的内在联系，为板蓝根药材的质量鉴别提供了一项依据。本研究发现，采自菘蓝第1年的根的板蓝根药材，横切面上韧皮部面积大，淀粉多，粉性大，质脆，生物碱含量高。而收集种子后采收的板蓝根药材, 质硬, 横切面上木质部面积大,占半径的6/7～7/8，且薄壁组织中无淀粉粒，生物碱含量低，质量不好，不宜药用，这与有关研究结果[8]相符 。本研究的结论对于菘蓝新品种的培育及其药材质量评价有一定的理论指导价值。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：20-21，191-192.

[2] 肖珊珊，金郁，孙毓庆．板蓝根化学成分、药理及质量控制研究进展[J].沈阳药科大学学报，2003，20(6): 455-459.

[3] Dickison W C.Integrative plant anatomy[M].San Diego:Harcourt/Academic Press,2000:45-64.

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[6] 鄢丹，韩玉梅，骆骄阳，等.板蓝根木皮比与药效及化学成分的相关性分析[J].中药材，2011,34(1): 43-46.

[7] 刘倩倩，王康才，罗春红，等.不同品种类型菘蓝根中表告依春累积规律研究[J].中药材,2013,36(2): 199-201.

[8] 冯毓秀，夏光成，秦秀芹.板蓝根与马蓝根的形态组织特征[J].基层中药杂志,1993,7(1):1-3.

Anatomy and Histochemical Localization of Alkaloids in the Leaf and Root ofIsatisindigoticaFort.

LUO Xiaozheng,DAI Liping,LIU Mengqi*,CHEN Suiqing

(School of Pharmacy,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,China)

Microscopic characters and locality of alkaloids in the leaf and root ofIsatisindigoticawere studied by normal microscopy and histochemical methods.The results showed that trichomes were not found on both adaxial and abaxial leaf surface ofI.indigotica.Anomocytic stomata were distributed on both surfaces.Stomatal density of abaxial surface was obviously higher than that of adaxial surface.The mesophyll consisted of palisade parenchyma and spongy parenchyma.Palisade parenchyma was arranged in two layers of parenchyma cell.The root developed an obvious ring of cambium between xylem and phloem. A great number of starch grains were found in parenchyma cells of phloem.Distribution of alkaloids was observed in palisade parenchyma cells and spongy parenchyma cells in the leaves ofI.indigotica. Alkaloids were mainly distributed in parenchyma cells of phloem in the root.From these results, it could be deduced that the root ofI.indigoticawith a broader phloem in a cross section should be of better quality.

Isatisindigotica; anatomy; alkaloid; histochemical localization

2016-06-04

河南中医学院苗圃工程项目(MP2012-04)；2014年度河南中医学院省属高校基本科研业务费专项(2014KYYWF-ZZCX3-03)；国家中医药公共卫生专项(财社[201176]号)

罗晓铮(1973-)，女，河南新野人，副教授，硕士，主要从事药用植物资源开发与利用研究。 E-mail:luoxiaozheng@sina.com

*通讯作者：刘孟奇(1971-)，男，河南偃师人，副教授，博士，主要从事药用植物资源开发与利用研究。 E-mail:2009liumq@163.com

S567.2

A

1004-3268(2016)10-0119-04