河北太行鸡不同群体含黄素单氧化酶3基因多态性检测

赵思思，胡慧艳，贾 青,2*，孙凤莉，锡建中，李晓敏

(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000； 2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000； 3.河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000)

河北太行鸡不同群体含黄素单氧化酶3基因多态性检测

赵思思1，胡慧艳1，贾 青1,2*，孙凤莉3，锡建中1，李晓敏1

(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000； 2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000； 3.河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000)

为了研究含黄素单氧化酶3(FMO3)基因T329S突变位点在河北太行鸡不同群体中的等位基因及基因型频率分布情况，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)和DNA测序技术分别对赞皇、平山、唐县地区3个河北太行鸡群体FMO3基因及基因型频率进行检测。结果显示，平山地区太行鸡群体中未检测到SS型个体，而平山、唐县地区太行鸡群体中均有FMO3基因SS型个体；赞皇、平山、唐县3个太行鸡群体中T等位基因的频率分别为0.129 8、0.075 0、0.084 2，其频率均远低于等位基因A的频率。独立性卡方检验结果显示，不同群体间基因型频率分布差异不显著；经适合性卡方检验，赞皇、平山、唐县3个太行鸡群体卡方值分别为1.173 0(P>0.05)、0.035 1(P>0.05)、0.188 5(P>0.05)，说明该基因位点A→T碱基突变在3个群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态；通过分析3个不同群体遗传变异参数发现，3个太行鸡群体在该基因位点上均处于低度多态(PIC<0.25)。以上结果表明，河北太行鸡群体中FMO3基因型频率较低，可以通过PCR-RFLP的方法予以剔除。

河北太行鸡； 含黄素单氧化酶3基因； PCR-RFLP； 基因型频率

含黄素单氧化酶3 (flavin-containing monooxygenase 3,FMO3)是一种重要的肝微粒体酶，在体内主要参与外源性物质和其他一些化学物质的氧化代谢。FMO3基因多态性与多种疾病的发生密切关联，其中以鱼腥味综合症最为典型，因而FMO3基因又名鱼腥味基因。Humbert等[1]首次报道了鱼腥味综合症(又名“原发性三甲胺尿”)，为一种罕见的常染色体隐性遗传疾病。三甲胺(TMA)作为机体循环物质，能够被FMO3氧化代谢形成无毒的氮氧化合物被清除体外，但患有鱼腥味综合症者机体会排出大量TMA[2]。由于TMA具有类似腐烂鱼气味，因而TMA也是污染环境的成分之一[3]。Lunden等[4]报道了牛FMO3基因第六外显子上存在1个无义突变，导致该基因表达提前终止，突变个体产生鱼腥味牛奶；Vondell等[5]首次报道了鱼腥味鸡蛋，这与鸡的FMO3基因第七外显子上存在的1个无义突变密切相关，该突变位点使得第694位碱基由A突变为T，引起329位氨基酸由苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，故将该位点定义为T329S，此突变位点改变了该基因进化上的1个高度保守五肽基序FATGY，使得机体代谢TMA的FMO3活性下降，造成TMA氧化能力降低，从而使TMA不能排出体外。Hobsonfr等[6]于1973年证实了TMA是引起鸡蛋鱼腥味的主要物质，并且携带鱼腥味鸡蛋蛋黄中TMA的含量为正常鸡蛋蛋黄中含量的10倍，影响鸡蛋的经济价值。王晓亮等[7]通过对10个地方鸡种的研究发现，供试鸡种均存在鱼腥味综合征易感个体，但易感基因型频率都不高；马旭东等[8]对引进高产商品蛋鸡进行研究，结果表明，3个品种经过选育后完全不含易感等位基因，表明该位点是可以通过分子标记手段将不利等位基因剔除，这对提高鸡蛋品质有重要意义。

太行鸡(河北柴鸡) 原产于河北的太行山区和山麓平原，中心产区主要在河北省西部的太行山区。太行鸡属于蛋肉兼用型，其蛋肉品质优良，营养成分含量丰富，具有适应性强，耐粗饲等优点，是河北省优良地方品种[9]。随着人们生活水平的不断提高，地方鸡种因具有蛋肉品质优良、营养成分含量丰富等自身独特的优势，深受消费者的青睐。但目前关于太行鸡FMO3基因T329S突变位点的研究尚未见报道，为此，采用PCR-RFLP对河北太行鸡FMO3基因T329S突变位点进行检测，分析该位点等位基因在不同群体中的分布情况，以期在分子水平上为太行鸡选育过程中剔除鱼腥味易感基因、提高蛋品质提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品采集

试验样品分别采自赞皇(104只)、平山(95只)、唐县(100只)3个不同太行鸡群体。采用真空采血管翅下静脉采血1～2 mL，柠檬酸钠抗凝剂处理后置于-20 ℃冻存备用。

DNA提取试剂盒购北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶BsrⅠ购自NEB公司，TaqDNA聚合酶、DNA Marker购自北京TransGen生物技术有限公司。

1.3 引物设计

根据GenBank中鸡FMO3的基因序列(登录号AJ431390)，获得含T329S突变位点的序列信息[10]。应用Primer Premier 5.0引物设计软件，针对T329S位点设计引物，引物序列为：F：5′-CAGGGTGGTATCAAGCCTGT-3′；R：5′-GATCCAAAGGACTGGACCAA-3′，由北京华大科技公司合成。

1.4 DNA提取及PCR扩增

全血DNA提取参照血液基因组提取试剂盒说明书进行。采用10 μL PCR反应体系：ddH2O 7.1 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，DNA模板(100 ng/μL) 0.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。取2 μL PCR扩增产物电泳检测，并在凝胶成像系统下观察PCR扩增情况。序列测定由北京华大科技公司完成。

1.5 酶切反应

继代培养过程中2.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA组合培养基上长出了根，对组培苗驯化，将其移栽到自然环境中，有1株和其他香龙血树明显不一样，在叶片上出现了金边(图5a)，而野生型植株叶色表现全绿(图5b)，可能是体细胞变异，使香龙血树表现型出现了差异，虽然市场上已经有金边香龙血树，但该研究中的金色叶缘变异和现有的金边性状还存在很大差异，可能是一种新的变异类型。这种变异产生的原因是否属于可遗传的变异，以及后代能否100%保持这种变异还有待进一步研究。

采用PCR-RFLP方法检测太行鸡个体FMO3基因的基因型。酶切体系为10 μL：灭菌ddH2O 4 μL，10×Buffer 0.5 μL，PCR产物5 μL，BsrⅠ限制性内切酶0.5 μL。酶切温度为67 ℃，反应 2 h。PCR产物酶切完成后，经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。并在凝胶成像系统下观察、拍照。

1.6 统计分析

采用POPGENE 32软件分别计算不同太行鸡群体该基因位点的遗传变异参数，应用SPSS 19.0统计软件进行卡方检验。

2 结果与分析

2.1 DNA提取及PCR扩增

太行鸡样品基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一、整齐、清晰，亮度较好，无降解现象，即基因组DNA的完整性好(图1)。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶(含0.05% GV)电泳检测，结果见图2。从图2可以看出，PCR扩增产物大小与预期片段(369 bp)大小一致，且没有特异性扩增条带，可直接用于PCR-RFLP分析。

图1 血样基因组DNA提取结果

图2 FMO3基因PCR扩增结果

2.2 PCR扩增产物序列分析

为进一步提高基因分型的准确性，将PCR扩增产物测序，检测A→T碱基突变情况(图3)。该位点变异产生3种基因型，该位点的纯合子命名为TT基因型和SS基因型，杂合子为TS基因型，此位点突变为错义突变，使得329位编码的氨基酸由苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，将该位点定义为T329S。

图3 FMO3基因T329S位点测序图谱

2.3 PCR-RFLP分析

[11]的结果，根据电泳图带型对太行鸡个体进行基因型分型，只有 369 bp 1个条带，即判定为SS型；出现 369、226、143 bp 3个条带，即判定为ST型；出现226、143 bp 2个条带，即判定为TT型。PCR产物酶切完成后，经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测可见，太行鸡3个群体中FMO3基因SS型、ST型、TT型均有分布(图4)。

图4 河北太行鸡FMO3基因突变位点的

2.4 遗传分析

2.4.1 基因型频率与基因频率 由表1可知，河北太行鸡3个群体中携带鱼腥味综合征易感基因型SS型及TS基因型个体所占比例远远小于TT基因型个体，均表现出TT>TS>SS的趋势。赞皇、平山、唐县地区3个群体中FMO3基因变异位点上检测到T等位基因的频率分别为0.129 8、0.075 0、0.084 2，其频率均远低于等位基因A的频率。经卡方适合性检验，赞皇、平山、唐县地区3个群体卡方值分别为1.173 0(P>0.05)、0.035 1(P>0.05)、0.188 5(P>0.05)，说明该基因位点A→T碱基突变在3个群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。独立性卡方检验表明，不同群体基因型频率分布差异不显著。

2.4.2 遗传变异参数 由表2可知，赞皇太行鸡群体的杂合度较平山、唐县群体高，但3个太行鸡群体在该基因位点上均处于低度多态(PIC<0.25)，表明3个群体在多态位点上的多样性相似，将携带FMO3基因纯合型(SS)和杂合型(ST)个体从群体中剔除相对较容易。

表1 不同群体FMO3基因变异位点基因及基因型频率

表2 不同群体FMO3基因T329S的遗传变异参数

3 结论与讨论

本研究通过PCR-RFLP方法检测了不同太行鸡群体FMO3基因T329S位点多态性。结果显示，该位点存在2个等位基因A、T。本试验在平山太行鸡群体中未检测到SS型个体，可能是由于所选地方鸡种为散养，采样群体较小所致；在赞皇、唐县太行鸡群体中均检测到3种基因型个体，其FMO3基因型SS型基因型频率分别为0.028 8、0.010 5。这与刘伟等[11]、初芹等[12]的研究结果基本一致。通过遗传变异参数分析发现，3个太行鸡群体在该基因位点上均处于低度多态(PIC<0.25)，且不利等位基因T在3个太行鸡群体中的频率分别为0.129 8、0.075 0、0.084 2，其频率均远低于等位基因A的频率。FMO3等位基因T在林甸鸡、绿壳蛋鸡、北京油鸡群体中基因频率平均为0.005～0.250[13-15]。本研究结果表明，在太行鸡群体中，针对该位点等位基因在不同群体中的分布情况，是可以通过分子标记辅助手段加强选种选育，将携带FMO3基因个体剔除，这为今后在提高太行鸡蛋品质方面提供了重要的参考。

参考文献:

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[5] Vondell J H.Is the production of “off-flavor” eggs an individual characteristic[J].Poultry Sciences,1932,11:373.

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[8] 马旭东,姚俊峰,涂盈盈,等.引进高产商品蛋鸡FMO3敏感基因及其基因型频率分布研究[J].中国家禽,2012,34(24):18-20.

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[10] Honkatukia M,Reese K,Preisinger R,etal.Fishy taint in chicken eggs is associated with a substitution within a conserved motif of theFMO3 gene[J].Genomics,2005,86(2):225-232.

[11] 刘伟,詹凯,李俊营,等.安徽部分地方禽种FMO3基因频率分布研究[J].中国家禽，2014,36(5):11-13.

[12] 初芹,张爱平,张剑,等.三个优质地方鸡种中鱼腥味基因的检测[J].中国家禽,2015,37(14):7-12.

[13] 邱家维,王志鹏,张元良,等.林甸鸡玫瑰冠、鱼腥味和矮小性状的遗传基础分析[J].中国家禽,2015,37(14):7-12.

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Polymorphic Detections of Flavin-containing Monooxygenase 3 in Different Populations of Taihang Chickens in Hebei

ZHAO Sisi1,HU Huiyan1,JIA Qing1,2*,SUN Fengli3,XI Jianzhong1,LI Xiaomin1

(1.College of Animal Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China; 2.National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas,Baoding 071000,China; 3.Husbandry and Veterinary Research Institute of Hebei,Baoding 071000,China)

In order to study the distribution of T329S mutation in flavin-containing monooxygenase 3 (FMO3) in different populations of Taihang Chickens in Hebei.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) followed by DNA sequencing assay was used for detecting the frequency of genotype and allele ofFMO3 gene in three populations of Taihang Chickens.The results showed that no individual would lay fishy taint eggs in Taihang Chickens of Pingshan,fishy taint susceptible individuals with genotype SS were detected in another two groups.The frequency of T allele was 0.129 8,0.075 0 and 0.084 2,which was much lower than A allele,respectively.The Chi-square test result showed that there were no significant differences among the three populations with its genotype frequencies,and the Chi-square value were 1.173 0(P>0.05),0.035 1(P>0.05) and 0.188 5(P>0.05),which were fit with Hardy-Weinberg equilibrium in different populations of Taihang Chickens in Hebei.As for the genetic parameters showed that the three populations of Taihang Chickens were all intermediate polymorphism on this locus.In conclusion,the frequencies of fishy taint genotype of Taihang Chickens in Hebei was not high and the susceptible individuals could be easily detected by PCR-RFLP method.

Taihang Chickens in Hebei;FMO3 gene; PCR-RFLP; genotype frequencies

2016-04-26

河北省科技计划项目(14236602D)

赵思思(1990-)，女，河北栾城人，在读硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖。E-mail:zssdk2314@163.com

*通讯作者：贾 青(1964-)，男，河北河间人，教授，博士，主要从事动物遗传育种研究。E-mail:jiaqing@hebau.edu.cn

S831.2

A

1004-3268(2016)10-0134-04