一种人血白蛋白和聚乙二醇衍生物水凝胶的制备与性能研究

李丹，汪伟，祝文斌，林高品浙江省杭州市亚慧生物科技有限公司，浙江杭州　310052

一种人血白蛋白和聚乙二醇衍生物水凝胶的制备与性能研究

李丹，汪伟，祝文斌，林高品
浙江省杭州市亚慧生物科技有限公司，浙江杭州310052

目的以人血白蛋白和聚乙二醇衍生物为主要成份构建了外科手术封合剂水凝胶。方法抽取该院2015年8月—2016年5月收集的人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝胶在5 d后即能降解60%，在12 d时仅残余少量水凝胶，具有良好的生物降解性。胀破强度试验结果显示聚人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝胶的胀破强度（16.5± 4.1）kPa显著高于外用冻干人纤维蛋白粘合剂（1.3±1.0）kPa。结果L929细胞在人血白蛋白/聚乙二醇衍生物凝胶浸提液中形态正常，MTT检测表明人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝胶无潜在的细胞毒性。 结论聚乙二醇衍生物和人血白蛋白凝胶具有凝胶速度快、胀破强度高、组织粘附性好和细胞毒性低的特点，人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝胶为肺部外科手术后封合提供了一种新的选择。

白蛋白；聚乙二醇衍生物；水凝胶；封合剂

［Abstract］Objective to establish a surgical sealant based on the Human Albumin and polyethylene glycol derivatives as the main components.Methods From August 2015 to May 2016 the Human Albumin/PEG derivative hydrogel was able to degrade 60%after 5 d，with only a small amount of hydrogel in 12 d，which had good biodegradability.The bursting strength test results showed that the bursting strength（16.5+4.1）kPa was significantly higher than that of the freeze-dried human fibrin adhesive（1.3±1.0）kPa.Results The morphology of L929 cells was normal in the gel extract of Human Albumin/，and the MTT test showed that there was no potential cytotoxicity of the.Conclusion Poly（ethylene glycol）derivatives and human serum albumin gel with gel speed，bursting strength high，tissue adhesion and low cytotoxicity，human serum albumin/polyethylene glycol derivative hydrogels after lung surgery letter provided the a new selection add Conclusion.

［Key words］Albumin，Polyethylene glycol derivatives，Hydrogel，Sealing agent

肺部手术后漏气是肺切除和胸膜剥脱术等胸部手术后常见并发症［1］。漏气可能会引起严重的并发症，包括支气管胸膜瘘、延长胸腔引流置管时间引起的感染、延长恢复时间和增加住院费用等。纤维蛋白胶、氰基丙烯酸酯、GRF（甲醛交联的明胶-间苯二酚）、GR FG（戊二醛和甲醛交联的明胶-间苯二酚）等材料已经用于外科手术封合或止血，也被用于肺部手术后防止漏气，但是效果并不明显。聚乙二醇在药物修饰、药物载体、生物材料表面修饰以及水凝胶领域都有广泛的研究与应用。基于人血白蛋白和聚乙二醇衍生物（聚乙二醇二琥珀酰亚胺琥珀酸酯，PEG-SS2）开发了一种新型外科手术封合凝胶，并对该凝胶作为肺部外科手术封合剂的可能性做了初步探索。

1　试验

1.1试剂与仪器

PEG-SS2购于北京凯正生物工程发展有限责任公司。人血清白蛋白（25%）购于奥地利奥克特珐玛药剂生产有限公司。外用冻干人纤维蛋白粘合剂购于上海莱士血液制品股份有限公司。风干肠衣为市售。UV-5300型紫外可见光分光光度计，胀破强度检测采用自制设备。

1.2试验过程

1.2.1凝胶时间检测采用试管翻转法检测凝胶时间。将聚乙二醇衍生物溶于缓冲液，分别配置成50、100、200 mg/mL和400 mg/mL的溶液。0.5 mL的人血清白蛋白溶液与0.5 mL的聚乙二醇衍生物溶液在1.5 mL离心管中混合。混合后开始计时，每隔5 S翻转离心管，直至离心管内液体不能流动，此时的时间即为凝胶时间。

1.2.2溶胀性能检测将1 mL人血清白蛋白溶液与1 mL聚乙二醇衍生物溶液混合后，浇注到长25 mm× 宽25 mm×深3 mm的模板中，形成凝胶后，取一定质量（W0）的凝胶放入离心管中，按照1 g/10 mL浸泡在0.1 M的PBS，在37℃水浴中孵化4 h。取出凝胶，用滤纸吸干表面水份后称重，称量其质量为W1，凝胶溶胀度计算公式为：溶胀度=（W1-W0）/W0×100%。

1.2.3体外降解 将1 mL人血白蛋白溶液与1 mL聚乙二醇衍生物溶液混合后，喷涂到长25 mm×宽25 mm× 深3 mm的模板中，形成凝胶后，取一定重量的人血白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝胶，置于聚四氟乙烯板上，冷冻干燥至恒重（W0），将冻干后的凝胶放入离心管中，按照1 g/10 mL的比例浸泡在0.1 M PBS水中，在37℃水浴中孵化。每隔24 h取出凝胶，冷冻干燥后称重（Wt），记录凝胶的质量变化，凝胶的重量保持率=Wt/W0×100%。

1.2.4细胞毒性 细胞毒性试验是用体外细胞培养方法进行毒理学风险评价。该次试验是按国际标准ISO 10993.5-2009《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》的MTT法进行的。无菌条件下，将所有溶液分别用0.22 μm滤头过滤除菌；将水凝胶按照1 g/10 mL的比例浸提于MEM培养液中，置于37℃、5%CO2、湿度为100%的恒温培养箱中孵化24 h，得到浸提液。在此次试验条件下，该外科手术封合剂100%试验液为试验组1，50%试验液为试验组2，25%试验液为试验组3，12.5%试验液为试验组4。阳性对照为10%DMSO溶液。阴性对照为高密度聚乙烯按每0.2 g阴性对照加1 mL细胞培养基的比例，在60 rpm条件下（37±1）℃，浸提（24±2）h。介质对照为不含试验液的细胞培养基，处理同试验组。将样品试验液，阴性对照、阳性对照的浸提液及介质对照分别放于6个培养着L929小鼠成纤维细胞的细胞培养板孔内，在5% CO2，37℃细胞培养箱中培养，24 h后显微镜下观察试验样品组、阴性对照组、阳性对照组及介质对照组培养后的细胞形态学改变，并用MTT法测定各供试品组（样品组、阴性对照组、阳性对照组）相对于介质对照组的细胞存活率。

2　结果与讨论

2.1凝胶时间

外科手术封合凝胶前体溶液，喷涂到在体内形成凝胶，如果凝胶化时间过快，有可能还没完全注射入体内，就形成凝胶，不利于临床操作；如果凝胶化时间过长，注射入体内后会在组织创面流动，甚至可能被体液稀释，无法凝胶。聚乙二醇衍生物PEG-SS2与人血白蛋白溶液混合后，PEG-SS2活化端基和人血白蛋白组分自由氨基形成酰胺键，交联形成水凝胶。交联剂浓度增加，凝胶速度增加。PEG-SS2浓度为25mg/mL时，90 S以后未形成凝胶，溶液变粘稠；PEG-SS2浓度为50mg/mL时，凝胶时间为50 s；PEG-SS2浓度为100 mg/mL时，凝胶时间为20 s；PEG-SS2浓度为200 mg/mL时，凝胶时间为15 s；PEG-SS2浓度为400 mg/mL时，凝胶时间为15 s。交联剂PEG-SS2浓度由25 mg/mL增加到100 mg/mL，PEG-SS2活性端基浓度也越高，凝胶时间越短。PEG-SS2浓度达到200 mg/mL，凝胶时间变化不明显，在此后的研究中，PEG-SS2浓度设定为200 mg/mL。

2.2溶胀性能

溶胀性是指凝胶吸收液体后自身体积明显增大的现象，是表征生物材料吸水性能比较简单的方法［2］。该研究采用凝胶吸水后的质量变化百分比来反应凝胶的溶胀性能。凝胶吸水后质量增加。随着凝胶前体溶液中PEG-SS2的浓度增加，溶胀比呈减少趋势，由50 mg/mL的196%降低到400 mg/mL的65%，可能的原因是高浓度交联剂条件下形成了更多的交联点，限制了凝胶的溶胀。

2.3粘弹性

从粘弹性检测结果可以看出，PEG-SS2浓度为200 mg/mL时，凝胶储能模量G'和损耗模量G''分别约为12 300 Pa和50 Pa。人血白蛋白和PEG-SS2混合5 min后，水凝胶模量在检测时间内变化不大，表明反应已经充分。

2.4显微结构

水凝胶内部存在多孔结构。水凝胶的这种多孔结构为水分子的进出提供了路径，允许水溶性物质如养分、代谢物通过，有利于组织创面的修复与再生。

2.5体外降解

体外水解，水凝胶在6 d后降解比例超过60%，在12 d时仅残余少量水凝胶。证明水凝胶具有良好的生物降解性。

2.6细胞毒性

培养24 h后，在倒置相差显微镜下观察L929细胞形态。结果表明，水凝胶浸提液各试验组3细胞形态正常，贴壁生长良好，细胞基本上呈梭性或不规则三角形，与正常细胞形态相似。与介质对照组相比，试验组1的细胞存活率为98%，试验组2的细胞存活率为99%，试验组的细胞存活率为%%，试验组4的细胞存活率为96%。因此，在此次试验条件下，该外科手术封合剂100%试验液无潜在的细胞毒性［3］。

2.7胀破强度

胀破强度是外科手术封合剂重要指标之一，胀破强度以及凝胶破坏方式可以反应凝胶在组织表面的粘附性以及凝胶本体强度。Gonotti等在一项多中心的前瞻性随机试验中研究了肺部手术切除后纤维蛋白胶封合能力，发现纤维蛋白胶能够显著降低肺部手术后气体漏气持续时间。Moser等在一项前瞻性的随机试验中，研究了肺减容手术中使用纤维蛋白胶对于气体漏气时间和置管引流时间的影响［4］，发现使用纤维蛋白胶后持续漏气时间和留置引流时间都显著降低，22例使用纤维蛋白胶的病人仅1例发生术后持续性漏气［5-10］，而22例对照组病人有7例发生术后持续性漏气，胸腔置管引流时间分别为（2.83± 1.96）d和（5.88±2.96）d。白蛋白/聚乙二醇衍生物水凝胶胀破强度为16.5 kPa，显著高于纤维蛋白胶胀破强度（1.3 kPa）。

3　结语

基于聚乙二醇衍生物和人血白蛋白凝胶具有凝胶速度快、胀破强度高、组织粘附性好和细胞毒性低的特点，该水凝胶有望用于肺部手术后漏气封合。

［1］周虹，王华光，刘丽宏，等.468例人血白蛋白临床应用调查与分析［J］.中国药物应用与监测，2014（5）：311-314，315.

［2］徐峰.人血白蛋白275例临床应用调查分析［J］.现代实用医学，2013，25（3）：334-336.

［3］严汝庆.人血白蛋白临床应用研究进展［J］.中国热带医学，2013，13（7）：902-905.

［4］韩一波，宣泽胜.人血白蛋白使用的临床药学干预［J］.医学信息，2013（29）：447.

［5］朱素燕，徐萍，刘瑶，等.人血白蛋白临床应用1580例调查与分析［J］.中国药物与临床，2015（1）：22-25.

［6］王松.呼吸机膜材料的选择及其生物相容性［J］.中国组织工程研究，2012，16（12）：2221-2224.

［7］李荣，王衡东，王文峰，等.聚丙烯无纺布亲水性与血液相容性改性初步研究［J］.中国输血杂志，2012，25（11）：1165-1169.

［8］石强，门小菲，赵杰，等.用于血液存储与输注的聚丙烯材料的制备［J］.中国输血杂志，2011，24（11）：933-935.

［9］毛志刚，陈朝辉，韩宏光.人工血管材料生物相容性和血液相容性的研究与分析［J］.中国组织工程研究，2012，16 （16）：2981-2988.

［10］陈欧，邱雄，邵泽勇，等.血液透析膜生物相容性及在重症胰腺炎中的应用［J］.中国组织工程研究，2016，20（8）：1177-1182.

Preparation and Properties of a Kind of Human Albumin and Polyethylene Glycol Derivatives

LI Dan，WANG Wei，ZHU Wei-bin，LIN Gao-pin
Hangzhou City，Zhejiang Province，Ya Hui biological Science and Technology Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang Province，310052 China

R313

A

2096-1782（2016）08-0005-03

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.08.005

李丹（1982.11-），浙江杭州人，博士，中级工程师，研究方向：生物医用材料。

2016-06-05）