濒危植物珙桐大小孢子形成和雌雄配子体发育观察

陈兴银，张玉晶，张凯凯，杨 鹏，石建明

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

濒危植物珙桐大小孢子形成和雌雄配子体发育观察

陈兴银，张玉晶，张凯凯，杨 鹏，石建明*

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

利用石蜡切片法对不同发育阶段的珙桐花器官进行解剖并研究。结果表明：花药壁的发育类型是双子叶型，小孢子母细胞减数分裂过程中的胞质分裂为同时型，四分体为四面体型。成熟花粉粒为二细胞型，具有3个萌发沟。珙桐的胚珠为直立胚珠，厚珠心，单珠被，胚囊为单孢子发生类型，为典型的蓼型胚囊发育方式，通过连续切片的观察，没有发现大小孢子发生及雌雄配子体形成的异常。

珙桐；大孢子；小孢子；雄配子体；雌配子体

珙桐(DavidiainvolucrateBaill.)具有鸽子树的美称，中国特有的单型属植物。珙桐科仅一种和一变种，即珙桐和光叶珙桐(D.involucratevar.vilmoriniana(Dode)Wanger)[1-2]。珙桐具有很高的观赏价值，不仅是世界上认可的著名观赏树种，也是绿化园林的理想树种。自珙桐被发现后，被大量引种繁殖，目前的分布范围已跨越自生自然生长环境的地理分布，其趋势是北移和低海拔[3]。1897年法国传教士从中国带回珙桐种子开始，“中国鸽子树”珙桐开始走出国门，被北美和欧洲广为种植，成为世界著名的观赏树种。江苏、浙江、福建、河北、北京、安徽、郑州、南京、上海、武汉等城市已成功引入珙桐[4-5]。珙桐起源古老，是第三纪古热带植物的孑遗树种，属国家一级保护植物[6-8]。珙桐是一种更新困难，种子发芽率低的树种，有关珙桐的研究主要集中在珙桐的生长环境、生物学特性、群落特征、遗传多样性、生理生化等方面，而有关珙桐的细胞学生物学研究较为少见[9-11]。本研究利用石蜡切片方法，对珙桐大、小孢子发生和雌雄配子体发育过程进行了解剖观察，为珙桐的胚胎学研究积累资料，揭示珙桐的繁育特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

材料采自贵州省林业科学研究院和贵州省植物园，从花芽分化到果实成熟各个阶段的材料均有采集，花芽或花序用50%FAA固定液固定。

1.2 实验方法

本实验采用石蜡切片法[12]。材料经过酒精梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚度8～10 μm)、番红-固绿染色、加拿大树胶封片等过程。再用Olympus SZ 61体视镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 小孢子发生和雄配子体的形成

2.1.1 小孢子形成

珙桐花药中孢原细胞经过分裂，形成初生造孢细胞，初生造孢细胞再分裂，形成次生造孢细胞(图1：a)。次生造孢细胞排列紧密，其进一步发育为小孢子母细胞，小孢子母细胞体积较大，无显著液泡，细胞核为染色较深的圆球体(图1：b)。

小孢子母细胞进入减数分裂第一次分裂，即细线期(图1：c)，细胞体积迅速增长，核中出现细长缠绕成团的染色质丝。随后同源染色体进行配对，染色质丝清晰可见，即为偶线期(图1：d)、丝状染色体增粗变短，进入粗线期(图1：e)、之后染色体变粗缩短，二价染色体交叉形成V字形、十字形，即为双线期(图1：f)、双线期后，进入终变期(图1：g)、终变期结束后进入减数第一次分裂中期(图1：h)、同源染色体分离且数目减半，即减数第一次分裂后期(图1：i)、染色体移至两极后开始消失，减数第一次分裂末期(图1：g)，随后进入第二次减数分裂，即间期Ⅱ(图1：k)、前期Ⅱ(图1：l)、中期Ⅱ(图1：m)、后期Ⅱ(图1：n)、末期Ⅱ(图1：o)，最后形成四分体(图1：p)。在减数分裂时期，珙桐小孢子母细胞的胞质分裂为同时型，四分体时期，珙桐小孢子四分体为四面体型。

2.1.2 雄配子体发育

四分体时期，胼胝质壁溶解，单核小孢子从四分体中游离出来，单核小孢子细胞壁薄，胞质浓厚，核位于细胞中央。随后，细胞核和细胞质被移向细胞的一侧，此时花粉进入单核靠边期(图1：q)。最后，单核花粉粒进行一次不均等的有丝分裂形成含有一个营养细胞和生殖细胞的二细胞的花粉粒，即成熟花粉(图1：r)。

2.1.3 花药壁的发育

珙桐花药含有4个花粉囊，两侧两个花粉囊相通，中间为药隔。花粉囊内含有许多花粉粒(图1：s)。花药在发育的初期，结构简单，外围一层幼龄的表皮，内侧为一群形态相同的分生细胞。随着花药的发育，在花药四角的表皮内方，出现一些分裂旺盛的细胞，即孢原细胞。

孢原细胞进行平周分裂，形成外层壁细胞和内层造孢细胞。壁细胞继续进行平周分裂和垂周分裂，由外向内逐渐形成药室内壁、中层和绒毡层，和表皮一起组成了花粉囊的壁(图1：b)。在小孢子母细胞减数分裂形成小孢子的过程中，药室内壁细胞径向延长，纤维加厚，又称为纤维层，其作用被认为有助于花药的开裂。药室内壁在形成纤维层时，在2个花粉囊交接处的外侧，留下一狭条形的薄壁细胞，即唇细胞，花粉粒成熟以后，花药在此处开裂，花粉随即散出。花药成熟时，花粉壁仅剩花药内壁和残存的表皮，中层细胞逐渐吸收解体；在四分体时期，绒毡层在原位出现解体的迹象，为分泌型绒毡层(图1：q)。

图1 珙桐小孢子发生和雄配子体的形成Fig.1 The Microsporogensis and Development of Male Gametophyte ofDavidia involucrate a.造孢细胞；b.小孢子母细胞时期；c.减数分裂第一次前期Ⅰ细线期；d.偶线期；e.粗线期；f.双线期；g.终变期；h.减数分裂第一次中期Ⅰ,箭头示染色体排列在赤道板两侧；i.后期Ⅰ，箭头示染色体均等分布在两极；j.末期Ⅰ；k.减数分裂第二次间期Ⅱ；l.前期Ⅱ；m.中期Ⅱ；n.后期Ⅱ；o.末期Ⅱ；p.四分体时期；q.单核靠边期；r.成熟花粉时期；s.花横切；Ep.表皮；En.药室内壁；MI.中层；Ta.绒毡层细胞；MMC.小孢子母细胞；

2.2 大孢子形成及雌配子体发育

2.2.1 大孢子形成

珠心组织是一团相似的薄壁细胞，在靠近珠孔一端表皮下分化出单一的孢原细胞。孢原细胞进行一次平周分裂，形成周缘细胞和造孢细胞。周缘细胞进一步发育为珠心组织。造孢细胞(图2：b)发育为大孢子母细胞，大孢子母细胞(图2：c)经过减数分裂后形成四分体，四个细胞排列成纵行(图2：d)。靠近珠孔的3个细胞逐渐退化，靠近合点端的大孢子发育成功能大孢子。

图2 珙桐大孢子发生和雌配子体的形成Fig.2 The Megasporogenesis and Development of Female Gametophyte of Davidia involucratea.雌蕊结构；b.孢原细胞；c.大孢子母细胞；d.四分体时期；e.功能大孢子；f.二核胚囊；g.四核胚囊；h.八核胚囊；i.形成中央细胞；AC.孢原细胞；Me.大孢子母细胞

2.2.2 雌配子体发育

雌配子体的发育开始于成熟的功能大孢子(图2：e)。功能大孢子继续发育，形成单核胚囊。单核胚囊经历一次有丝分裂发育成2核胚囊(图2：f)，胚囊周围的珠被内表皮细胞也继续径向延伸，变得扁平。随后2个核分别移向珠孔和合点的位置，并进行第2次有丝分裂，进入4核时期(图2：g)。4个核各自进行第3次有丝分裂，形成8核胚囊结构(图2：h)。此时，胚囊的两端各有4个核，之后，两端各有1核移向中央，形成具有2极核(图2：i)的中央细胞。合点端的3个细胞为反足细胞。珠孔端的3个细胞共同构成卵器，即1个卵细胞和2个助细胞。靠近中央细胞的是卵细胞，助细胞则位于两侧并靠近珠孔端。

2.2.3 子房的结构

珙桐的子房一般是6～10室，是多心皮复雌蕊，心皮在中央出联合形成中轴，胚珠着生于中轴上，为中轴胎座(图2：a)。每室1胚珠，单珠被，厚珠心，直立胚珠。雌蕊分化早期，在心皮腹缝线处子房内表皮下有细胞分裂增生，产生一些分裂旺盛的细胞，即胚珠原基，这些细胞经分裂逐渐增大，形成一团状突起，其上部即为珠心组织。珠心组织下部形成珠柄，与胎座相连。珠心基部表皮细胞分裂较快，逐渐把珠心包围形成珠被。珠被在珠心顶端形成1个开口，称为珠孔。

3 结论

珙桐小孢子母细胞减数分裂为同时型，小孢子在四分体中排列属四面体型。成熟花粉为二胞花粉粒，具有3个萌发沟。花药壁的发育类型是双子叶型，绒毡层为分泌型绒毡层。

同一药室内小孢子母细胞的减数分裂基本同步，但是在同一花药内的不同药室之间、同一花序上的不同花药之间存在一定的差异。所以，在同一朵花开花后，4个药室散播花粉时期出现先后差异，使花粉散播的总时期延长，从而使传粉和受精的时间也有所延长。这种现象在自然界中是比较普遍存在的，是植物积极适应环境的一种表现[13]。在小孢子发生及雄配体发育过程的观察中未发现败育现象。珙桐子房是多心皮复雌蕊，通常6～10室，每室1胚珠。珙桐胚珠为直立胚珠，单珠被，厚珠心，胚囊为单孢子发生类型，为典型的蓼型胚囊发育方式。

张征云等[14]认为珙桐濒危是种子败育所导致。周志琼[15]观察珙桐的雌配子体发育过程发现，雌配子体在发育过程中存在一定比例的未发育和败育的胚珠，败育的胚珠约占整个胚珠的10%，认为可能是大孢子或雌配子体发育不正常导致。通过连续切片观察，没有发现大小孢子发生及雌雄配子体形成的异常，其结果与李雪萍等[16]对大小孢子及雌雄配子体的发育观察结果一致。在野外采集珙桐不同发育时期的花序时，发现有子房萎缩退化，还有一些雌花不能正常发育成幼果的现象及幼果过早脱落的现象，因此认为珙桐的濒危和其自身的生殖过程中的某一环节出现异常现象有关，这直接导致了珙桐不同程度的生殖失败，进而引起了自身濒危的现象。

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The Megasporogenesis and Microsporogensis and Development of Female and Male Gametophyte of Endangered plantsDavidiainvolucrate

CHENXing-Yin,ZHANGYu-jing,ZHANGKai-Kai,YANGPeng,SHIJian-ming*

(CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Anatomical structure of the floral organ ofDavidiainvolucrateat different developmental stage was studied by paraffin section method. The results showed that the anther wall could be defined as basis development type, which belonged to dicotyledonous type. The meiosis of microsporocyte was the simultaneous type at cytokinesis, while tetrahedral type at the tetrad stage. The mature pollen belonged to 2-cell type with three germination ditch. The ovule of D. involucrate was atropous ovule, with crassinucellus and unitegmic. Embryo sac was single spore type, which was a typical polygonum type embryo-sac development pattern. No abnormal development was found in the megasporogenesis, microsporogensis and female and male gametophyte by serial sections observation.

Davidiainvolucrate, Megaspore, Microspore, Female Gametophyte, Male Gametophyte

2016-09-05；

2016-09-26

贵州省自然科学基金(黔科合J字[2014]2124)。

Q944.5

A

1008-0457(2016)06-0035-05 国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.06.006

*通讯作者：石建明(1962-)，男，副教授，主要研究方向：植物学；E-mail:guanp508@163.com。