两种血小板浓缩物修复兔硬腭软组织缺损的形态学观察

何婷婷,王 拓,陈红亮,孙 勇

·论著·

两种血小板浓缩物修复兔硬腭软组织缺损的形态学观察

何婷婷,王 拓,陈红亮,孙 勇

目的对比观察两种血小板浓缩物修复兔硬腭软组织缺损的形态学效果,评价其临床应用价值。方法将54只日本大耳白兔随机分为A、B、C 3组,于兔硬腭前部中份制备软组织缺损模型,缺损区分别植入自体改良型富血小板纤维蛋白(A-PRF)膜(A组)、自体富血小板纤维蛋白(PRF)膜(B组)或不做任何处理(C组),分别于术后 3、7、11、15、21、28 d行形态学观察,计算创面愈合率。结果(1)形态学观察：术后 7 d内,A组和B组创面炎性反应轻微,A组更优,C组炎症反应明显。术后15 d,A组和B组无显著差异,创面黏膜上皮覆盖完整,均无组织凹陷,无瘢痕形成;C组在愈合过程中出现了不同程度的组织凹陷,有瘢痕组织形成。(2)创面愈合率：术后 3 d,3组无明显差异(P>0.05);术后 7、11 d,A组与B组之间无明显差异(P>0.05),A组和B组均明显高于C组(P<0.05)。结论APRF、PRF均能减轻创伤区域的炎症反应,减少瘢痕形成,加速创面愈合。

血小板浓缩物;软组织缺损;形态学观察;创面愈合率

软组织缺损的重建是口腔种植临床上经常面对的难题。外科手段、生物学和组织工程材料等常被应用于口腔临床软组织重建中[1-3］。外科手段一般需开辟第二术区,增加患者痛苦。有价值的生物细胞及生长因子等则需要在严格的无菌培养环境中进行较长时间的培养才能获得。人体血小板浓缩物(platelet concentration,PC)中含有大量能促进骨和软组织再生的生长因子[4］,且可快速有效地获得组织重建细胞,避免使用昂贵的外源性生长因子,免去复杂手术的痛苦,亦更安全可靠。

Choukroun等[5］发现并制备的第二代血小板浓缩物-富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF),临床和动物实验证实其具有促进软组织再生的作用[6-8］。Ghanaati等[9］于2014年提出了一种与PRF离心速度和时间不同的改良型富血小板纤维蛋白(advanced platelet-rich fibrin,A-PRF),具有比PRF总量更高、更丰富的生长因子。但A-PRF较之PRF是否具有更好的促进口腔软组织再生的能力,尚待大量临床和动物实验证实。本研究在兔硬腭区制备软组织缺损模型,对比观察两者促进软组织愈合的效果,为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 54只雄性3月龄健康日本大耳白兔,2.0～2.5 kg,由四川省成都达硕实验动物中心提供及饲养管理,生产许可证号：SYXK(川)2014～189。所有动物均先在同一条件下适应性分笼喂养1 w。实验过程均按照动物伦理学要求进行各项处置。

1.2 实验材料 PRF真空无菌采血管(5 ml),APRF真空无菌采血管(10 ml)(江苏创英医疗器械有限公司);TDZ4-WS低速离心机(中国湘仪集团);纤维蛋白成型处理工具盒(法国Process,Nice);Surgic XT Plus种植机(日本NSK);Ti-SG20L种植手机(日本NSK);5.0 mm组织环切钻(MCT,韩国);普通透明薄膜等。

1.3 方法 54只日本大耳白兔随机分为A、B、C 3组,每组18只。随机选取实验动物,称重后固定,使用A-PRF/PRF专用离心管通过兔耳中央动脉采集4 ml血液,迅速离心：A-PRF(2000 r/min,24 min)、PRF(3250 r/min,10 min)。离心后静置3～5 min,弃去上清液,用无菌有齿镊取出中间层凝胶,修剪并保留其下部少许红细胞层后,置于专用工具盒中压制成膜备用。

按1 ml/kg沿兔耳缘静脉缓慢推注3%戊巴比妥钠,麻醉起效后,将其以仰卧位固定于手术台,常规消毒铺巾;于兔硬腭前部中份制备直径5 mm软组织缺损(环切钻中心点位于距上颌后排门齿4.5 mm的硬腭中线处),剥离黏骨膜露出骨面,充分止血。分别于A、B两组动物软组织缺损处填入按缺损大小修剪后的A-PRF膜或PRF膜,缝合固定。C组软组织缺损经充分止血后,不做任何处理。

术后连续3 d肌注青霉素钠(10万U/kg,1次/d),食软食1 w。口内缝线任其自然脱落。

1.4 观察指标 分别于术后3、7、11、15、21、28 d行大体形态观察。使用透明薄膜描记创面大小后,修剪成创面大小并称重,以薄膜的重量来反映创面面积。创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积[10］。

1.5 统计学方法 应用 SPSS 23.0统计软件分析,计量资料以±s表示,采用单因素方差分析,P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察 术后3 d,A、B两组缝线均未脱落,A-PRF膜及PRF膜均稳固附着于创面,且有少量吸收,创面轻度红肿;C组创缘红肿明显,可见新鲜肉芽组织,触之点状出血。术后 7 d,A、B两组肉眼见膜基本吸收,创面缝线大部分自行脱落,A组创面无明显炎症及红肿反应,B组尚见轻微红肿,两组愈合面积均达原创面面积的1/2;C组创面红肿仍明显,呈凹陷缺损。术后11 d,A、B组愈合面积达原创面积的 4/5;C组创面基底也可见黏膜上皮覆盖,仍可见明显组织凹陷。术后15 d,A、B组创面上皮覆盖基本完成,质地较软,色泽欠红润,未见明显瘢痕组织;C组创面仍呈凹陷状,创面边缘有瘢痕形成。术后21 d,A、B两组创面黏膜色泽、质地均与正常黏膜无明显差异,且A组更优;C组仍存少量组织凹陷,瘢痕组织明显。术后28 d,C组见明显瘢痕组织,未见组织凹陷。

2.2 创面愈合率 在术后3 d,各组创面愈合率无统计学差异(P>0.05);术后 7、11 d,A组与B组的创面愈合率无显著差异,但均较C组更高(P< 0.05)。在术后15、21、28 d,A组及B组创面愈合率为100%。在各时间节点,A组创面愈合率均最高,B组次之,C最低。见表1。

表1 各组不同时间点创面愈合率的比较(n=18)

3 讨论

创伤后的组织愈合大致经历止血期、炎性反应期、肉芽形成期、组织重塑期4个阶段[10］,主要包括机体抵御炎性反应、血管新生、结缔纤维组织形成几个方面。当损伤发生后,血小板迅速在创面局部聚集形成血凝块,同时,血小板被活化后脱颗粒释放各种生长因子,这些生长因子能够促进大量中性粒细胞、单核/巨噬细胞在创伤区聚集浸润,释放大量炎性介质, 如白细胞介素(1L-1、1L-4、1L-6)、TNF-α等,吞噬杀灭细菌、清除创面的坏死组织及碎屑,发挥着抗炎、抗感染的免疫作用[12］。各种生长因子与纤维蛋白结合可促进与软组织愈合相关的环节,成纤维细胞不断成熟,并继续增殖分化,在相关生子因子作用下不断合成胶原纤维,损伤区被结缔纤维组织、新生血管及上皮组织等组织覆盖,从而具有一定强度,最终形成稳定的瘢痕[13-14］。总之,血小板及其释放的各种生长因子在创伤愈合各阶段都很重要[15］。

PRF凝胶中富含全血中约97%的血小板及＞50%的白细胞,具有与血凝块结构类似的疏松三维立体纤维蛋白网状结构,能够为细胞的迁移、附着及增殖分化提供支架,血小板及白细胞如黏结剂一样嵌入其中,各种细胞因子被滞留于其中缓慢节律性释放[12,16］。A-PRF与PRF制备的离心速度及时间不同,由＞97%的血小板及少量血细胞组成,呈疏松三维立体网状结构,具有比PRF总量更高的血小板和白细胞[9］。Eizaburo等将PRP、PRF和A-PRF行体外温育培养,评估15 min、60 min、8 h、1 d、3 d、10 d时生长因子的释放情况,采用ELISA定量分析PDGF-AA、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、TGFB1、VEGF、EGF、IGF等生长因子的释放量,结果3种血小板浓缩物中释放最多的生长因子依次是PDGF-AA、PDGF-BB、TGFB1、VEGF和PDGF-AB,温育15～60 min,PRP释放的生长因子显著高于PRF和A-PRF,60 min后至第10 d,A-PRF释放的总生长因子及血清总蛋白量最高,可长期稳定高效地释放生长因子[4］。

本实验形态学观察显示,在创伤愈合早期(术后7 d内),C组的炎性反应明显较A组及B组严重,而A组与B组相比,前者红肿炎症程度相对较轻,说明APRF与PRF均有一定的抗炎能力,但在创伤愈合早期(术后7 d内),A-PRF抗炎效果更好。而在创伤愈合中后期,APRF与PRF抗炎效果相当,这与二者的生长因子释放特点基本吻合。

本实验仅通过形态学肉眼观察创面愈合情况,分析各组的创面愈合率,初步评估创面愈合质量,尚待后续通过HE染色、Masson染色、CD105免疫组化染色等对各组的炎性反应、新生血管化、胶原的合成与降解进行量化比较,进一步评估创面愈合质量。

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Morphological observation on two kinds of PC in repair of rabbit hard palate soft tissue defects

He Tingting1,2,Wang Tuo3,Chen Hongliang2,Sun Yong1,21.Medical College of Stomatology,Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan,646000,China;2.Department of Stomatology,the Institutional Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan, 610011,China;3.Department of Stomatology,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan,637000, China

ObjectiveTo compare the morphological observation of two kinds of platelet concentration (PC)in repair of rabbit hard palate soft tissue defects and evaluate the clinical application value.MethodsA total of 54 Japanese big ear white rabbits were selected and randomly divided into groups A,B and C.Soft tissue defect models were made in rabbit hard palate.A-PRF membrane and PRF membrane were implanted into the defects in groups A and B respectively.The defects in group C were not treated.The morphology was observed three,seven,11,15,21,28 days after the treatment to calculate the wound healing rate.Results(1) Morphological observation:seven days after the operation,there was minor wound inflammatory response in groups A and B.Group A was better.Inflammatory response in group C was obvious.15 days after the operation,there was no significant difference between groups A and B.The mucosal epithelial cover was complete without tissue depression or cicatrization,and there was tissue depression at varying degrees and cicatrization in the process of healing in group C.(2)Wound healing rate:three days after the operation,there was no significant difference among the three groups(P>0.05).Seven and 11 days after the operation,there was no significant difference between groups A and B(P>0.05),and the wound healing rate in groups A and B was much higher than that in group C (P<0.05).ConclusionBoth APRF and PRF can relieve the inflammatory response in wound area,reduce scar formation,and accelerate the wound healing.

PC;soft tissue defect;morphological observation;wound healing rate

R 782.22

A

1004-0188(2016)11-1225-03doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2016.11.001

2016-06-30)

成都军区“十二五”科研面上项目(C14050)

646000四川泸州,西南医科大学口腔医学院(何婷婷,孙 勇);成都军区机关医院口腔科(何婷婷,陈红亮,孙 勇);川北医学院附属医院口腔科(王 拓)

孙 勇,电话：028-86687041