水生无脊椎动物血淋巴细胞分类及免疫研究进展

吴芳丽,王 月,尚跃勇,严桂珍,孔 辉,胡梦红,吕为群,王有基

(上海海洋大学水产与生命学院,上海201306)

水生无脊椎动物血淋巴细胞分类及免疫研究进展

吴芳丽,王 月,尚跃勇,严桂珍,孔 辉,胡梦红,吕为群,王有基

(上海海洋大学水产与生命学院,上海201306)

水生无脊椎动物的血淋巴细胞是机体免疫防御屏障的重要组成部分,但对不同水生无脊椎动物的血淋巴细胞分类和功能的研究整体上比对脊椎动物的研究落后。本研究中系统地归纳和综述了贝类、甲壳类、棘皮动物等水生无脊椎动物血淋巴细胞的分类及其免疫功能的研究进展,贝类血淋巴细胞的分类主要以染色后细胞质中颗粒物质的有无作为指标,一般分为颗粒细胞(granulocyte)和透明细胞(hyalinocyte),其防御机制主要通过包囊作用、伤口修复、吞噬作用等方面体现;甲壳动物血淋巴细胞的分类主要依据血淋巴细胞的形态特征和胞质中颗粒物质的有无、大小和密度等特征,一般将其分为无颗粒细胞(hyaline cell)、小颗粒细胞(semi-granular cell)和大颗粒细胞(granular cell),透明细胞和小颗粒细胞共同介导吞噬作用,小颗粒细胞还介导包囊作用,大颗粒细胞主要介导细胞毒作用;棘皮动物的细胞免疫主要由体腔细胞即变形吞噬细胞或颗粒细胞完成。建议未来应使用多种方法和技术以及结合血淋巴细胞表面受体对水生无脊椎动物血淋巴细胞进行分类和功能研究。

水生无脊椎动物;甲壳类;贝类;血淋巴细胞;免疫

水生无脊椎动物具有很高的食用与药用价值,甲壳动物和软体动物是水产养殖中较为常见的水生无脊椎动物。由于其摄食特性,水生无脊椎动物可大量清除水环境中的有机物和重金属污染物,并可作为水环境污染的指示种[1]。在水产养殖中,不少无脊椎动物易发生大规模疾病,而对其发病机理仍不明确,没有有效的防治措施。因此,持续对水生无脊椎动物免疫学的研究和有效免疫防治方法的探索一直受到学者的重视[2]。目前,水生无脊椎动物疾病预防和治疗中抗生素的大量使用已导致了抗药性细菌的出现,同时也对环境产生了不良影响,实践证明,这种做法不足取[3]。从长远来看,增强水生无脊椎动物对疾病的抵抗力以及改良水产养殖环境才是当代水产养殖可持续发展的有效途径。水生无脊椎动物大多数为开管式循环系统,不存在特异性体液免疫,主要依靠其血淋巴细胞的非特异性免疫进行防御。水生无脊椎动物的血淋巴细胞对机体的免疫功能有着直接影响,是机体免疫防御屏障的重要组成部分。对水生无脊椎动物血淋巴细胞的研究有助于进一步研究其对病原体、环境压力[4](如盐度、气候变化、缺氧和海洋酸化等)和海洋污染物(如农药、有机污染物和重金属等)的免疫应答。目前,对水生无脊椎动物血淋巴细胞的研究大多集中在贝类和甲壳类动物中,本研究中主要以这两类水生无脊椎动物为对象,对血淋巴细胞的分类和免疫功能进行了综述,以期为水生无脊椎动物的水产养殖、病害防治和水生动物免疫学研究提供参考。

1 贝类血淋巴细胞的分类及免疫功能

贝类免疫学研究始于1862年,因贝类缺乏特异性免疫功能,其免疫防御功能依赖于天然免疫的相关机制,这些免疫防御机制主要由贝类的血淋巴细胞形成。近年来,随着经济贝类养殖规模的不断扩大,一些由病菌性或者寄生虫引起的贝类疾病频繁出现,给贝类养殖业造成了重大经济损失[5-6],研究贝类血淋巴细胞的分类、形态、结构和功能,了解其在机体免疫过程中的作用,对有效缓解和解决经济贝类的一些病原性病害问题尤为重要。

1.1 贝类血淋巴细胞的分类

近年来,对贝类血淋巴细胞的分类已进行了大量研究,但由于其分类方法因人而异,特别是不同种贝类的血淋巴细胞在形态上存在较大差异,迄今为止仍无严格统一的标准[7]。分类方法上多采用显微镜和电镜观察并结合细胞染色技术,对各类细胞在形态大小和嗜酸碱性上进行分类,或借助流式细胞术对大小和粒度存在差异的血淋巴细胞进行分类[8]。基于以上常见分类法,研究者综合应用一些技术和方法对血淋巴细胞的分类提出了新见解,为贝类血淋巴细胞的分类研究开启了新的局面。目前,已有的分类方法包括单克隆抗体技术、流式细胞术、密度梯度离心法、免疫探针技术、植物凝集素标记法、酶细胞化学技术等。

1.1.1 基于化学染色的分类 通过细胞化学染色方法,Bayne等[9]将加州贻贝Mytilus californianus的血淋巴细胞分为大嗜碱性透明细胞、小嗜碱性透明细胞和嗜酸性颗粒细胞3个细胞亚群。一般来说,嗜酸性颗粒细胞具有吞噬能力,而嗜碱性透明细胞无吞噬能力;Xing等[10]将栉孔扇贝Chlamys farreri的血淋巴细胞分为颗粒细胞和透明细胞;根据血淋巴细胞对染色反应和超微结构的不同, Moore等[11]将紫贻贝Mytilus edulis血淋巴细胞分为有颗粒的嗜酸性细胞和无颗粒的嗜碱性细胞(可细分为吞噬性巨噬细胞和小淋巴细胞)2个亚群,且分析认为嗜碱性无颗粒细胞也具有吞噬能力,这与Bayne等[9]的观点不一致。通过细胞化学染色方法对海湾贝类血淋巴细胞分类可以发现,一般海湾贝类血淋巴细胞可分为透明细胞和颗粒细胞两大类,但对于嗜酸性颗粒细胞和嗜碱性无颗粒细胞是否均具有吞噬能力尚不能确定,现阶段大部分学者认为颗粒细胞具有较强的吞噬能力。

1.1.2 基于透射电镜技术的分类 通过透射电镜技术,陈全震等[12]将皱纹盘鲍Haliotis discushannai血淋巴细胞分为淋巴样细胞、透明细胞、特殊颗粒细胞、大颗粒细胞和小颗粒细胞5种类型。沈亦平等[13]研究认为,大、小颗粒细胞只是血淋巴细胞内颗粒的大小不一,而特殊细胞具有较强的代谢功能被认为有可能是大、小颗粒细胞的原始细胞,透明细胞和淋巴样细胞则是根据结构类似脊椎动物淋巴细胞推测的结果,并认为颗粒细胞具有吞噬能力,透明细胞则不具备,这与Bayne等[9]的结论一致。利用光镜和电镜技术,Wootton等[14]将浅沟蛤Scrobicularia plana的血淋巴细胞分为嗜酸性颗粒细胞、嗜碱性颗粒细胞和嗜碱性无颗粒细胞3种类型,并观察到嗜酸性颗粒细胞相对嗜碱性颗粒细胞颗粒较少而空泡较多,嗜碱性无颗粒细胞的胞体较小,核较大。利用光镜和电镜技术,Aladaileh等[15]根据血淋巴细胞颗粒的有无和核质比将悉尼岩石牡蛎Saccostrea glomerata血淋巴细胞分为淋巴样细胞、透明细胞和颗粒细胞3种类型。通过透射电镜技术对海湾贝类血淋巴细胞的分类研究可以发现,分类依据相对于细胞化学染色法更加细致,避免了染色影响因素的干扰,但分析结果干扰因素多,如不能排除一些颗粒中的杂质,就会影响无颗粒细胞和有颗粒细胞的区分。

1.1.3 基于流式细胞术的分类 利用流式细胞术, Ashton-Alcox等[16]和Goedken等[17]将美洲牡蛎Crassostrea virginica的血淋巴细胞分为颗粒细胞、中间型细胞和透明细胞3种类型,根据其双参数点图,可以发现一类介于透明细胞和颗粒细胞大小之间的中间型细胞;刘东武等[18]依据血淋巴细胞在总血淋巴细胞中所占的比例,将紫石房蛤Saxidomus purpuratus和中国蛤蜊Mactra chinensis的血淋巴细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞和透明细胞3种类型,并认为贝类不同个体的血淋巴细胞组成可能与其所处的生理状态和外界环境等因素有关;许秀芹等[19]将虾夷扇贝Patinopecten yessoensis、海湾扇贝Argopecten irradians和太平洋牡蛎Crassostrea gigas的血淋巴细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞和透明细胞3种类型,先依据细胞内含颗粒数量多少分为透明细胞和颗粒细胞,然后根据血淋巴细胞大小,把介于中间大小的颗粒细胞分类出来,即把颗粒细胞进一步分类;王有基等[20-21]利用流式细胞仪技术结合光镜和电镜,将翡翠贻贝Perna viridis血淋巴细胞分为颗粒细胞、半颗粒细胞和透明细胞,其中根据细胞的大小,将半颗粒细胞又分为小半粒细胞和大半粒细胞,这与刘东武等[18]和许秀芹等[19]的分类相似;Xue等[22]将欧洲扁牡蛎Ostrea edulis血淋巴细胞分为颗粒细胞、大透明细胞和小透明细胞3个亚群,其中大、小透明细胞是基于透明细胞的大小进行的进一步分类,这与Li等[23]对马氏珠母贝Pinctada fucata血淋巴细胞的分类一致。利用流式细胞术结合细胞化学染色,Allam等[24]将美洲牡蛎Crassostrea gigas的血淋巴细胞分为小颗粒细胞、颗粒细胞和非颗粒细胞3类,将硬壳蛤Ruditapes philippinarum血淋巴细胞分为非颗粒细胞和颗粒细胞2种类型,这与Accorsi等[25]利用流式细胞术结合光镜和透射电镜对淡水福寿螺Pomacea canaliculata血淋巴细胞的分类一致。Travers等[26]发现,欧洲鲍Haliotis tuberculata血淋巴细胞中只有极少数的嗜碱性颗粒细胞,大多数为透明细胞。基于流式细胞术的研究成果可以发现,杂质在试验过程中影响因素降到最低,所设的阈值能够更加精确地计算颗粒数,进一步避免了人为因素的干扰。另外,血淋巴细胞分类从细胞个体大小有了更进一步的细分。Xue等[27]和Goedken等[17]指出,显微观察不利于血淋巴细胞亚群的定量功能评估,而流式细胞术可以快速、准确和定量分析血淋巴细胞形态学和相关免疫功能,为研究贝类血淋巴细胞提供了新方法。而且,通过流式细胞仪检测可发现,贝类不同类型的血淋巴细胞免疫功能上存在差异[20-21]。

1.1.4 基于单克隆抗体技术的分类 利用单克隆抗体技术,Noël等[28]研究认为,贻贝血淋巴细胞的亚群至少可以区分出3种不同类型;Dyrynda等[29]将紫贻贝血淋巴细胞分为嗜酸性颗粒细胞、嗜碱性粒细胞和透明细胞3种类型;Carballal[30]将地中海贻贝Mytilus galloprovincialis血淋巴细胞分为小颗粒细胞、大颗粒细胞和透明细胞3种类型;利用单克隆抗体技术结合流式细胞术,Renault等[31]将欧洲扁牡蛎血淋巴细胞也分为颗粒细胞、大透明细胞和小透明细胞3种类型,这与Xue等[22]利用流式细胞术对欧洲扁牡蛎血淋巴细胞的分类结果完全一致。基于单克隆抗体技术对海湾贝类分类的研究成果可以发现,分类结果与前两种并无很大的差别,单克隆抗体具有特异性高、抗原专一性等特点,鉴定分类敏感可靠,并且对于细胞膜表面结构具有深度识别作用。

1.1.5 基于其他方法的分类 通过密度梯度离心法,Xue等[27]将欧洲扁牡蛎血淋巴细胞分为小透明细胞、大透明细胞和颗粒细胞3种类型。利用酶细胞化学技术,并结合光镜和电镜技术,Russell-Pinto等[32]也将欧洲鸟尾蛤科的一种贝类Cerastoderma edule的血淋巴细胞分为3种类型:第一类,体积较大且具伸展性,表面褶皱,细胞核偏离中心,细胞质内含有细胞器,对酸性磷酸酶和酯酶呈阳性的Ⅰ型细胞;第二类,呈球形、表面光滑、细胞核位于中心,细胞质内少有细胞器,对酸性磷酸酶和酯酶呈阴性的Ⅱ型细胞;第三类,呈圆形,细胞核较小且偏离中心,胞质中含有充满颗粒性物质囊泡的Ⅲ型细胞。

综上所述,在贝类血淋巴细胞分类中,以染色后细胞质中颗粒物质的有无作为主要的分类指标,贝类血淋巴细胞可分为颗粒细胞(granulocyte,含有颗粒物质,即含大量颗粒或少量颗粒)和透明细胞(hyalinocyte,不含颗粒物质或所含颗粒物质极少),这2种主要的细胞类型得到广泛认可。然而,在贝类血淋巴细胞的类型中也有特例出现,如扇贝的血淋巴细胞类型中就缺少颗粒细胞[33],故并不是所有的贝类血淋巴细胞均可分为颗粒细胞和透明细胞两类。Hine[33]认为,将双壳类血淋巴细胞简单划分为颗粒细胞和无颗粒细胞限制了人们对血淋巴细胞功能的认识,笔者认为,对每种贝类血淋巴细胞的分类应该单独对待,不设统一标准。透明细胞在几个贝类种中也无明确定义,有的称之为无颗粒细胞,且同一血淋巴细胞的功能不能简单推广到其他种。在不同种贝类的血淋巴细胞分类中,由于不能保证所研究的细胞系处于相同的发育阶段,可能出现用形态学手段不能相对准确区分的现象,因此,贝类血淋巴细胞的分类不应仅局限于上述两类细胞,在其研究中综合运用多种方法和技术很有必要。另外,在血淋巴细胞分类分析过程中,应进一步对各种生理、环境影响因素进行单一变量分析,以增加分类依据的严谨性。

1.2 贝类血淋巴细胞的免疫功能

贝类由于其滤食的特性,体内容易积累大量的细菌和异物,易成为一些病原体的载体,而贝类缺乏特异性免疫功能,主要靠先天性的细胞免疫和体液免疫来进行免疫防御[34]。参与贝类细胞免疫的细胞为血淋巴细胞[35],它们是贝类免疫系统的“骨干”[36],是贝类体内抵御外来病原微生物侵袭的主要“屏障”[37]。贝类血淋巴细胞的防御机制主要通过包囊作用、伤口修复、吞噬作用等方面体现[38-40]。细胞凋亡也是贝类血淋巴细胞防御机制中的一个重要作用,可防止一些病原体的传播,减弱炎症反应对周围组织的伤害[41]。有研究发现,贝类对环境压力做出反应的能力在很大程度上取决于其体内的细胞免疫功能[42],且一些环境因素,如温度[43]、盐度、营养物质和有毒物质[44]可直接影响贝类血淋巴细胞的免疫功能[45],其中,农药等污染物可以对贝类组织及细胞产生直接或间接的毒害作用,并能诱导其免疫系统改变[46]。另外,气候变化导致的海水酸化(pH降低)和温度升高也会对贝类血淋巴细胞的防御机制产生影响[23,47]。

1.2.1 吞噬作用 吞噬作用是贝类血淋巴细胞的主要防御手段,当病原体入侵时,血淋巴细胞主要是通过吞噬过程清除外来物。有证明显示,透明细胞和颗粒细胞均具有吞噬功能[48],但主要是颗粒细胞发挥吞噬作用[49]。颗粒细胞具有很强的吞噬能力,其吞噬能力虽然不受个体发育阶段的影响,但容易受温度、盐度[34-45]和一些药物[50]等外界环境因素的影响。贝类血淋巴细胞的吞噬过程包括对异物的趋化、吞入和杀伤降解[51]。趋化过程开始要根据血淋巴细胞表面受体与外来异物的表面信号分子的相互作用对异物进行识别,血淋巴细胞的表面性质及趋化因子决定识别后对异物附着的速率;对异物的吞入过程主要是通过血淋巴细胞上的伪足对其进行包绕,两边的细胞膜互相融合,异物就被吞入细胞内即形成吞噬泡或吞噬体(phagosomes);对异物的杀伤降解主要由含有一些水解酶类(如葡萄糖苷酶、磷酸酶、蛋白酶和酯酶等)的溶酶体与吞噬体结合形成消化泡,被吞入细胞内的异物由溶酶体内的水解酶逐步消化分解为低分子物质,从而被机体消化吸收。除了吞噬作用外,伴随其产生的呼吸爆发过程对异物也有一定的杀伤作用。此过程会产生大量的超氧阴离子自由基,超氧阴离子进一步反应产生其他活性氧中间体(reactive oxygen intermediates,ROIs)(如羟基自由基、单线态氧和过氧化氢等),从而对外源物起到氧化杀伤作用。另外,贝类血淋巴细胞免疫防御中产生的一些免疫因子(如凝集素)等可增强宿主血淋巴细胞对病原体的吞噬作用[52]。

1.2.2 包囊作用 包囊作用是当外来异物的直径大于10μm时,血淋巴细胞发挥的免疫防御作用。当异物的直径大于10μm时(如寄生虫、外源植入物、坏死组织等),血淋巴细胞会大量聚集在异物周围形成包囊。随着时间的延长,越来越多的血淋巴细胞会聚集在异物处,包裹作用会逐渐加强,直至血淋巴细胞利用相关水解酶将异物消化吸收[53]。

1.2.3 伤口修复作用 伤口修复是贝类血淋巴细胞的另一重要作用。因为贝类没有血管、血小板和体液凝固因子,其循环系统为开放式循环系统,所以有别于脊椎动物的凝血修复系统。贝类的伤口修复是血淋巴细胞在受伤组织处大量聚集,形成血栓,由其产生的胞外基质逐渐替代受伤组织,再由血淋巴细胞发挥吞噬作用,将坏死组织清除,最后慢慢生长出新的组织的过程[54]。

2 甲壳类血淋巴细胞分类及免疫功能

2.1 甲壳类血淋巴细胞的分类

甲壳类动物的免疫防御功能主要依赖于血淋巴细胞的吞噬、包掩等细胞免疫反应[55]。目前,对甲壳类动物血淋巴细胞的分类及功能,虽然已有一些研究报告,但对于血淋巴细胞的分类及各自的功能尚无统一定论,研究者对血淋巴细胞的命名也不尽相同。从前期研究分析其主要原因:甲壳动物种类繁多,不同的学者在研究其血淋巴细胞时,所选择的试验对象、缓冲系统和抗凝剂等各异,采血方法、固定方法、染色方法和玻片保存时间等具体试验技术条件也各不相同,这些都可能导致观察到的3种甲壳动物血淋巴细胞的染色性能、形态特征、细胞胞质中颗粒物质数量及大小的差异[56],且各研究者又是根据不同的特点标准进行分类和描述。

自1885年Halliburton[57]对甲壳动物血淋巴细胞的研究开始,国内外学者对其分类及免疫特性的研究逐渐增多,但受染色技术、仪器等条件所限,进展较为缓慢。

2.1.1 基于化学染色的分类 根据螯龙虾Homarus anericanus血淋巴细胞的染色特性、核质比和细胞质所含颗粒物质的折光特性及形态特征,Cornick等[58]将其血淋巴细胞分为4种类型:细胞质中含有数目可变的小颗粒物质的嗜伊红颗粒细胞、个体最小的前透明细胞、细胞质内充满较大颗粒物质的嫌色细胞和含有少量颗粒物质的透明细胞。

利用吉姆萨染色和光镜,Sawyer等[59]根据蓝蟹Callinectes sapidus血淋巴细胞的形态特征、颗粒物质的有无及大小将其血淋巴细胞分为4种类型:细胞体积最大、细胞内含有的颗粒物质最多且颗粒较大的粗颗粒细胞;细胞质中含有一些细颗粒物质的细颗粒细胞;细胞质中含有少量颗粒物质且呈透明状的细颗粒透明细胞;细胞体积最小且细胞质中没有颗粒物质并呈透明状的无颗粒透明细胞。

2.1.2 基于透射电镜技术的分类 利用透射电镜技术,Bodammer[60]根据蓝蟹血淋巴细胞的形态特征和细胞质中颗粒物质的数量及大小将其分为3种类型:含有大量的颗粒物质且颗粒体积较大的颗粒细胞;不含或含有少量颗粒物质且颗粒体积较小的透明细胞;含有的颗粒物质数量适中且颗粒体积较小的半颗粒细胞。这与Parrinello等[61]利用电镜和光镜相结合的技术对北黄道蟹Cancer borealis和黄道蟹Cancer pagurus两种食用蟹的分类研究一致[61]。

2.1.3 基于密度梯度离心法的分类 利用密度梯度离心法,李光友等[62]和Martin等[63]根据血淋巴细胞的形态特征及免疫功能,将中国对虾Penaeus chinensis和两种单肢虾(Penaeus californiensis、Si-cyonia ingentis)的血淋巴细胞分为3种类型:细胞质内含有大颗粒物质的大颗粒细胞;细胞质内含有小颗粒物质且敏感易脱颗粒,并被认为是免疫防御反应关键的小颗粒细胞;细胞质内几乎不含颗粒物质且具有吞噬能力,但缺乏酚氧化酶活性的透明细胞。

2.1.4 基于其他方法的分类 利用光镜、梯度离心、细胞化学染色与透射电镜相结合的技术,叶燕玲等[64]根据血淋巴细胞及胞质内颗粒的特征,将中国对虾的血淋巴细胞分为颗粒细胞、小颗粒细胞和透明细胞3种类型,其细胞质内颗粒含量、体积和细胞大小依次递减。根据分类标准及对血淋巴细胞的具体描述可知,颗粒细胞即为李光友等[62]和Martin等[63]所定义的大颗粒细胞,无颗粒细胞即透明细胞;在大、小颗粒细胞上出现微管束,大颗粒细胞仅含电子致密大颗粒,透明细胞有一些亚显微结构并含变化颗粒(如匀质颗粒、条纹颗粒等),而小颗粒细胞则两者均有。其中,条纹颗粒的条纹由微管组成,Hearing等[65]认为,条纹颗粒的出现与凝血有关。

目前,十足目甲壳动物血淋巴细胞的命名与分类逐渐有了标准,其分类主要依据血淋巴细胞的形态特征和胞质中颗粒物质的有无、大小和密度等特征,一般将其血淋巴细胞分为3种类型:细胞质内含有大量且体积较大颗粒的颗粒细胞或大颗粒细胞(granular cell,GC);细胞质内含有数量适中且体积较小颗粒的小颗粒细胞(semi-granular cell, SGC);细胞质内几乎没有或含有微量且体积较小颗粒的透明细胞或无颗粒细胞(hyaline cell, HC)。

2.2 甲壳类血淋巴细胞的免疫功能

在甲壳类动物的非特异免疫防御中,血淋巴细胞随着血液循环分布到身体各处并发挥着重要作用,其对外来异物和病原的清除主要通过吞噬、凝集、包囊、结节形成、胞吐、修复、合成与释放免疫因子及一些物理屏障等途径来实现,其免疫系统缺乏免疫球蛋白,属先天免疫系统[66]。甲壳动物的血淋巴细胞既是细胞免疫的主要承担者[67],又可为体液免疫提供相应的免疫因子[68]。目前,大量对虾蟹类甲壳动物的血淋巴细胞的研究表明,其血淋巴细胞主要可分为3类:透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞,且不同类型的血淋巴细胞在其免疫系统中所起的作用不同[55,63,68-71]。透明细胞和小颗粒细胞共同介导吞噬作用,小颗粒细胞还介导包囊作用,大颗粒细胞主要介导细胞毒作用[68]。甲壳动物血淋巴细胞最重要的免疫防御机能是由透明细胞和小颗粒细胞介导的吞噬作用,具体包括异物的识别、黏连、聚集、摄入、清除等吞噬过程。

2.2.1 吞噬作用 甲壳动物3种类型的血淋巴细胞在形态学和细胞功能上均有所不同。甲壳动物无颗粒细胞(透明细胞)的细胞质中含有大量体积小、电子致密的圆形小体,且具有较高的核质比。透明细胞的光滑表面有一定的扩散和附着能力,具有较强的吞噬能力[69]。尽管其缺乏细胞内颗粒和酚氧化酶原,但透明细胞吞噬能力的激活可由细胞外活化的酚氧化酶原系统组分完成[72]。透明细胞多存在于病毒与细菌感染的组织内[73];小颗粒细胞的细胞质中不仅含有数目可变的小颗粒物质,还含有少量的酚氧化酶原和一些细胞器,其中普遍存在的细胞器有高尔基体、线粒体、内质网和核糖体等[62]。小颗粒细胞的吞噬活性只有在其与βG (β-1,3-glucan,β-1,3葡聚糖)或微生物多糖(脂多糖)结合导致脱颗粒后才被激活,在离体条件下小颗粒细胞很容易脱颗粒,从而释放有活性的酚氧化酶组分到血淋巴中,有研究表明,脱颗粒作用与其对异物的识别能力息息相关[69,72]。小颗粒细胞在免疫防御机制中具有活跃的识别异物的能力及胞吐作用,因此,小颗粒细胞被认为在免疫防御机制中发挥着重要作用[63,68-69];大颗粒细胞的细胞质中不仅含有数目可变的大颗粒,还含有少量的细胞器,如核糖体、内质网等,其中,此颗粒内还存在较多酚氧化酶原组分。大颗粒细胞扩散能力与附着能力较差,本身不具有吞噬能力,但用活化的酚氧化酶原系统的组分处理大颗粒细胞后,可以促进无颗粒细胞的吞噬性能,这主要因为在此处理下其可快速发生胞吐作用,产生一些有活性的酚氧化酶[69,72]。大颗粒细胞通过与β-1,3-glucan蛋白(β-1,3-glucan binding protein BGBP)或相对分子量为76 000的蛋白质结合也可实现脱颗粒,可能起到促进包囊或辅助识别作用[74]。

2.2.2 胞吐作用 Söderhäll等[72]认为,在机体的免疫防御过程中透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞间具有协同作用。大颗粒细胞和小颗粒细胞均可在异物刺激下引发胞吐、脱颗粒,释放活化的酚氧化酶,促进无颗粒细胞的吞噬能力,从而在机体的免疫反应中发挥作用。因小颗粒细胞具有活跃的识别异物的能力,当细菌或病毒等异物感染机体时,小颗粒细胞可对异物进行快速识别,并与异物表面异己信号物质相互作用使其快速发挥胞吐作用,与βG(β-1,3-glucan,β-1,3葡聚糖)或微生物多糖(脂多糖)结合进行脱颗粒,所产生的活化的酚氧化酶不仅可以促使小颗粒细胞和大颗粒细胞进行脱颗粒,还可以增强透明细胞的吞噬能力,从而使机体的免疫防御机制产生重要作用。

3 棘皮动物血淋巴细胞分类及免疫功能

棘皮动物的细胞免疫反应由几种体腔细胞完成,这些细胞形成了棘皮动物免疫效应的细胞体系。体腔细胞能对刺激产生反应,通过吞噬作用、包囊作用、细胞毒作用,以及合成、分泌凝集素和溶酶体酶等多种抗菌物质的方式来介导棘皮动物的细胞免疫机制。目前,对于体腔细胞的分类仍无统一标准,体腔细胞和血淋巴细胞的确切关系也未有定论。在棘皮动物的细胞研究方面,多侧重于体腔细胞,对血淋巴细胞的研究尚未见报道。有学者认为,体腔细胞相当于血淋巴细胞,体腔液类似于血液。大多数棘皮动物的体腔液内存在血淋巴细胞、吞噬变形细胞、振颤细胞、祖原细胞、晶体细胞、无色或有色球形细胞6类形态各异的细胞,但少数棘皮动物的体腔液中并不是都存在这6类细胞[75-76]。Arizza等[77]将海胆Paracentrotus lividus体腔液的细胞分为无色球形细胞、振颤细胞、阿米巴样细胞和红细胞4种类型,无色球形细胞是发挥细胞毒作用的主要细胞,同时能释放细胞溶解素,而且细胞溶解素能通过影响阿米巴样细胞来增加无色球形细胞的细胞毒作用。Pinsino等[78]将多棘海盘车Asterias rubens体腔液中的细胞分为4种类型:吞噬细胞、阿米巴样细胞、振颤细胞和血淋巴细胞,并证明了体腔细胞在机体外伤后的早期再生修复中起着重要作用。De Faria等[79]将海胆Echinometra lucunter体腔液细胞分为4种类型:阿米巴样细胞、振颤细胞、红色球形细胞和无色球形细胞,并发现阿米巴样细胞内含有大量颗粒,是机体中重要的炎症反应细胞。于志明等[80]在研究罗氏海盘车Asterias rollestoni时发现,体腔液中的细胞有大透明细胞、小透明细胞、大颗粒细胞(桑葚细胞)、小颗粒细胞、柳叶状细胞和兼性大细胞6种类型,其中小颗粒细胞质内含有数目可变的小颗粒物质,具有最强的吞噬能力,大透明细胞是细胞体积较大、细胞质中几乎不含或含有很少颗粒物质的细胞,对异物也有一定的吞噬能力,但是与小颗粒细胞相比吞噬能力较弱,对小颗粒细胞具有一定的黏附能力,大颗粒细胞和小透明细胞未发现有吞噬能力。李霞等[81]对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的研究表明,其体腔液中含有色素细胞和变形吞噬细胞两类细胞,在机体免疫反应中色素细胞可释放色素颗粒至体腔液中参与免疫反应,变形吞噬细胞对异物具有一定的吞噬能力。

4 展望

水生无脊椎动物由于缺乏真正的抗体和特异性免疫细胞,机体防御机制依靠非特异性细胞免疫反应,细胞免疫又主要依靠血淋巴细胞或体腔细胞完成。现今,除了贝类和甲壳类动物的分类和命名有大致标准外,对于其他无脊椎动物血淋巴细胞或体腔细胞的命名和分类尚无统一标准,且在不同物种中起主要免疫作用的细胞也不一致。贝类和甲壳类动物的细胞免疫主要由颗粒细胞完成,而棘皮动物的细胞免疫主要由变形吞噬细胞或颗粒细胞完成。通过对各类水生无脊椎动物血淋巴细胞的分类研究,可进一步了解各种免疫防御细胞在免疫过程中的作用,以便为后续相关研究提供理论依据。

相对于脊椎动物,水生无脊椎动物免疫学的研究起步较晚,主要因为其血淋巴系统的基础生物学研究较为欠缺,再加上水生无脊椎动物的种类多样,研究方式也不尽相同,造成了细胞分类的标准不同以及细胞功能研究的不统一性。因此,在未来使用多种方法和技术对水生无脊椎动物血淋巴细胞进行分类和功能研究非常必要,还可尝试通过构建模型或图谱对血淋巴细胞的免疫防御机制进行直观推理分析。在水生无脊椎动物养殖中,其病害种类繁多,渔药滥用导致病原产生抗药性,因此,对水产动物免疫增强剂的研究将越来越受到关注。从长远来看,提高水生无脊椎动物对疾病的抵抗能力和改良养殖环境是水产养殖可持续发展的有效途径。今后,对水生无脊椎动物血淋巴细胞的分类和功能研究需要结合病原感染和环境变异等实际问题进一步探究。

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Current progress of research on classification and immunity of hemocytes in aquatic invertebrates:a review

WU Fang-li,WANG Yue,SHANG Yue-yong,YAN Gui-zhen, KONG Hui,HU Meng-hong,LÜWei-qun,WANG You-ji
(College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai201306,China)

Immunology of aquatic invertebrates,as a branch discipline of aquaculture and aquatic biology,always attractsmuch attention of relevant researchers.Although classification and function of hemocytes of differentaquatic invertebrates have been widely investigated in the past years,a systematic review of classification and immune function of hemocytes has seldom been well proposed compared with vertebrates.Since many aquatic invertebrates are common aquaculture species,and havemany diseases frequently,hemocyte study is particularly importantas a natural immune defencemechanism.Research on classification and related immune functions of aquatic invertebrate hemocytes shows great significance to further enrich studies on immune functions and mechanisms in aquatic animals,and also provides theoretical basis for disease prevention in aquatic invertebrates.The cellular immunity of echinoderms is primarily involved in coelomocytes including phagocytes or granular cells.According to the relevant references both at home and abroad in recent years,this paper reviews the classifications and immune functions of hemocytes in molluscs,crustaceans and other aquatic invertebrates to provide theoretical basis for hemocyte study and disease control in aquatic invertebrates.

aquatic invertebrate;crustacean;mollusc;hemocyte;immunity

Q25

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.019

2095-1388(2016)06-0696-09

2016-04-01

国家自然科学基金资助项目(31302207);上海市自然科学基金资助项目(13ZR1455700)

吴芳丽(1993—),女,硕士研究生。E-mail:1033543663@qq.com

吕为群(1967—),男,博士,教授。E-mail:wqlv@shou.edu.cn

王有基(1981—),男,博士,副教授。E-mail:yj_wang@shou.edu.cn