不同培养条件对淡紫拟青霉菌体丝化的影响

2016-03-07 08:58张晓彦孟立强沙长青

黑龙江科学 2016年24期

关键词：分生孢子青霉发酵液

谷军，张晓彦，孟立强，沙长青

(1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010； 2.黑龙江省科学院，哈尔滨 150001)

不同培养条件对淡紫拟青霉菌体丝化的影响

谷军1，张晓彦1，孟立强1，沙长青2

(1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010； 2.黑龙江省科学院，哈尔滨 150001)

为提高生防用淡紫拟青霉菌株发酵产品中的孢子产量，降低产品中影响孢子形成的菌体丝化现象。采用控制发酵微生物的生理活动、调整生物的生活环境等方法来改变微生物的生长状态，控制发酵菌体的丝化率。通过调整发酵温度、控制培养原料成分和调整通气量等方法，效果明显，淡紫拟青霉的丝化比降到0.7以下。说明当采用淀粉代替容易利用的葡萄糖为碳源时，浓度为2%。同时控制阶段不同发酵的培养温度，前期(2 d)为28 ℃，后期为26 ℃，发酵时间6 d，淡紫拟青霉发酵液的丝化率为0.59，孢子数为1.6×109cfu/mL。

淡紫拟青霉；液体发酵；分生孢子；菌体丝化

淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)是线虫卵的寄生真菌，被认为是最具有应用前景的线虫生防真菌[1-4]，根结线虫(Meloidogyne.spp)是农作物害虫，分布广，会对许多经济作物造成严重危害。化学杀虫剂会导致农药残留、环境污染等问题，因此根结线虫病害的生物防治受到广泛重视。为促进淡紫拟青霉生防菌剂的推广应用，产出高活性的、生防效果好且方便使用的淡紫拟青霉生物菌剂尤为重要。

淡紫拟青霉在培养状态下，通常以孢子状态和菌丝体状态存在，多数会混合存在。以淡紫拟青霉为菌种制备生防制剂，希望发酵产品中的淡紫拟青霉以孢子状态存在，因为呈孢子状态的菌剂保质期长，繁殖能力强，生防效果好，国家也是以菌剂中的孢子数作为衡量产品质量的标准。本文通过不同培养工艺条件和不同培养原料需求的选择，减少了培养产品中的丝化现象，提高了淡紫拟青霉菌剂的孢子数，为淡紫拟青霉生防菌剂的扩大生产提供有益的帮助[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)，本实验室分离鉴定保藏。

1.1.2 试剂

磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、盐酸等试剂均为分析纯(AR)，蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物、几丁质，琼脂为生化试剂(BR)。

1.1.3 仪器

HWS 24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；SKY-1102C恒温震荡培养箱(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)；SP-756PC可见紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；YSQ-LS-100S11型立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)；DRP-9162电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)。

1.1.4 培养基

斜面试管培养基：可溶性淀粉2%，KNO30.10%，K2HPO40.10%， NaCl 0.05%，MgSO40.05%， FeSO40.001%，pH自然，琼脂2%。种子培养基: 液体种子培养基：蔗糖2%，蛋白胨1% ，K2HPO40.01%，NaCl 0.2%，MgSO40.01%，pH自然。发酵培养基：培养基1：高氏培养基。培养基2：察氏培养基。培养基3：察氏培养基+豆饼粉0.5%。培养基4：可溶淀粉1%，豆饼粉0.5%。培养基5：蔗糖1%，豆饼粉0.5%。培养基6：葡萄糖1%，豆饼粉0.5%。培养基7：蔗糖1%，酵母膏0.5%。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

孢子数的检测：采用血球计数器方法，准确称取淡紫拟青霉发酵液，加入到三角瓶，加入无菌水稀释至适当的倍数，利用血球计数器计数分生孢子量，重复3次，取平均值。丝化比的计算：将发酵好的淡紫拟青霉发酵液进行离心处理，转速为4 000 rpm，时间20 min，收集菌体进行干燥处理，并测定出1 000 mL发酵液所得到的菌体干重，为淡紫拟青霉发酵液对于菌体的收率。我们定义丝化比为：

1.2.2 种子培养方法

液体菌种的制备：在试管斜面保存菌种中挑起1接种环淡紫拟青霉孢子接种到液体种子培养基中，液体培养基的装量为500 mL三角瓶装100 mL培养基，然后在恒温培养振荡器 (SKY-1102C)中进行震荡培养，恒温振荡器温度28 ℃、转速为160 r/min，培养时间为4 d。检测分生孢子数达到2×108cfu/mL即可，培养得到的发酵液作为发酵的液体种子。固体菌种的制备：取培养好的斜面试管菌种，加入20 mL无菌水，将斜面试管中淡紫拟青霉分生孢子尽量洗脱下来，作为淡紫拟青霉固体发酵的种子准备。

1.2.3 发酵培养

按照淡紫拟青霉液体发酵培养基配比，配制培养基，将配好的培养基装入到500 mL的三角瓶中，装量为100 mL，121 ℃高压灭菌30 min，冷却至室温，接入液体种子1 mL或固体菌种，接种分生孢子的数量大约为2×108cfu/瓶，然后在恒温培养振荡器 (SKY-1102C)中进行培养，摇床转速为160 r/min、培养控制温度24 ℃～28 ℃，培养时间为4～10 d。

1.2.4 不同种子类型对淡紫拟青霉液体发酵丝化比的影响

分别采用液体种子和固体种子进行淡紫拟青霉液体发酵，发酵培养基采用4号培养基，发酵方法为1.2.3中介绍，在不同发酵时间取样进行发酵液中孢子数和菌丝丝化比的测定。

1.2.5 不同的培养基对发酵过程中丝化比和孢子数的影响

采用不同发酵培养基进行淡紫拟青霉液体发酵实验，培养基分别采用1、2、3、4、5、6、7号培养基，发酵方法为1.2.3中介绍，种子采用液体种子，发酵时间为5 d，发酵结束后检测淡紫拟青霉发酵液的孢子数和菌丝丝化比。

1.2.6 不同培养基浓度对丝化率和孢子数的影响

以4号培养基为基础培养基，分别调整培养基的固形物的浓度，检验对发酵液的孢子数和菌丝丝化比的情况。培养基浓度分别为4号培养基的0.5、1、1.5、2、2.5、3、4倍。发酵方法为1.2.3中介绍，发酵种子为液体种子，发酵时间为5 d，分别测定不同浓度培养基情况下发酵液孢子数和菌丝的丝化比。

1.2.7 培养基中无机盐对丝化率和孢子数的影响

验证培养基中常用无机盐对发酵液孢子数和丝化比的影响，以4号培养基为对照，在培养基中加入无机盐K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%。不同的发酵时间进行取样，分别测定发酵液的孢子数和菌丝的丝化比。

1.2.8 不同的发酵温度条件对丝化率和孢子数的影响

培养基配比为淀粉2%，豆饼粉1%，K2HPO40.10%、 MgSO40.05%、NaCl 0.05%。发酵温度分别控制在20 ℃、23 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，发酵种子采用液体发酵种子，发酵方法同1.2.3，发酵时间控制在5 d，发酵结束后测定发酵液孢子数、菌丝的丝化比。

1.2.9 不同的发酵时间对丝化率和孢子数的影响

培养基配比为淀粉2%，豆饼粉1%，K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%作为发酵培养基，发酵方法为1.2.3中介绍，发酵温度控制在26 ℃，种子采用液体种子，分别在发酵的2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d进行取样，测定发酵液的孢子数和菌体的丝化比。

1.2.10 不同的原料初始pH条件对丝化率和孢子数的影响

培养基配比为淀粉2%，豆饼粉1%，K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%作为发酵培养基，同时调整发酵培养基的原始pH值分别为3、4、5、6、6.5、7、8，发酵方法为1.2.3，发酵温度控制在26 ℃，种子采用液体种子，发酵时间控制为5 d进行取样，测定发酵液的孢子数和菌体的丝化比。

1.2.11 不同的通气量对丝化率和孢子数的影响

配制培养基，培养基配比为淀粉2%，豆饼粉1%，K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%，将配好的培养基装入到500 mL的三角瓶中，装量分别为50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL、175 mL、200 mL，121 ℃高压灭菌30 min，冷却至室温，接入液体种子1 mL，接种分生孢子的数量大约为1×108cfu/瓶，然后在恒温培养振荡器 (SKY-1102C)中进行震荡培养，恒温振荡器温度26 ℃、转速为160 r/min ，培养时间为6 d。测定发酵液中孢子数和菌体的丝化比。

2 结果与分析

2.1 不同种子类型对淡紫拟青霉液体发酵的影响

以4号培养基作为发酵培养基，分别接种液体种子和固体种子，发酵4 d、5 d、6 d、7 d取样测定淡紫拟青霉的发酵情况，结果如图1。

图1 不同种子类型对发酵的影响Fig.1 The influence of different seeds on fermentation

从图中可以看出液体种子前期发酵较快，7 d时孢子数达到最高峰，4～6 d时孢子数增长最快，6～7 d增长缓慢，固体种子前期发酵同液体种子发酵相比较慢，7 d时孢子数达到最高峰，5～6 d时孢子数增长最快，6～7 d增长缓慢。丝化比方面，二者都体现出前期较高，发酵后期逐渐降低，而采用固体种子进行淡紫拟青霉发酵更为明显。

2.2 不同的营养成分对淡紫拟青霉液体发酵的影响

2.2.1 不同的培养基对发酵的影响

分别选取1、2、3、4、5、6、7号培养基进行淡紫拟青霉液体发酵实验，5 d后测定发酵中的淡紫拟青霉的发酵液中分生孢子数和菌体丝化比，结果如表1。

表1 不同的培养基对发酵的影响

可以看出，4号培养基发酵液中的孢子数最高，2号培养基中虽然丝化比最低，但它的孢子数并不高，4、5、6号培养基的发酵生长状态较好，虽然丝化比较高，但产生的孢子数也较高。同1、2、3、7号培养基相比，更适于淡紫拟青霉的发酵生产，但分生孢子所占的比例不是很高，需要进一步优化。

2.2.2 不同培养基浓度对发酵的影响

以4号为基础配制浓度的培养基，分别为原培养基的0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0倍数。配成不同固形物浓度的发酵培养基，发酵培养淡紫拟青霉，5 d后测定淡紫拟青霉的发酵液中分生孢子数和菌体丝化比，结果如表2。

表2 不同固形物浓度的培养基对发酵的影响

从发酵结果得出，随发酵液培养基浓度的增加，淡紫拟青霉的分生孢子数和菌体的收率都在增加，而菌体收率增加要快于孢子数的增加，说明菌丝增加要优于孢子数的增加，但总孢子数也增加了，因而在生产中提高培养基的浓度还是有利于生产的。

2.2.3 培养基中无机盐对液体发酵的影响

以4号培养基为对照，同时对比的培养基中加入无机盐，比较无机盐对淡紫拟青霉发酵的影响，发酵6 d后，分别测定发酵液的孢子数和菌丝的丝化比，结果如表3。

表3 无机盐对淡紫拟青霉发酵的影响

从发酵结果得出，添加无机盐能非常明显地提高了发酵液中分生孢子数，对菌丝体的收率影响不十分明显。

2.3 温度对淡紫拟青霉液体发酵的影响

2.3.1 不同的发酵温度条件对淡紫拟青霉液体发酵的影响

分别在不同的发酵温度下进行淡紫拟青霉发酵试验，实验结果如表4。

表4 不同的发酵温度条件对发酵的影响

从发酵结果得出，淡紫拟青霉对温度要求还是很宽泛的，20 ℃～34 ℃都能很好地生长，最适生长温度为26 ℃，接近最适温度附近的菌体收率和孢子数都较高，丝化比较低，发酵温度高，终点时发酵液的pH偏高。

2.3.2 分段控制不同发酵温度对发酵的影响

将整个发酵过程分成3段，每段控制不同发酵温度，研究温度对淡紫拟青霉液体发酵的影响，结果如表5。

表5 分段控制发酵温度对发酵结果的影响

从表中可以看出第3批次的发酵效果最好，其次依次为2、5批次，可以看出前期采取高温，后期采取低温的控制方式最好，也就是说高温有利于菌丝的生长，低温更有利于孢子的形成。

2.4 不同的发酵时间对淡紫拟青霉液体发酵的影响

在淡紫拟青霉的液体发酵过程中，选取不同的发酵时间进行菌丝体收率和孢子数的测定，发酵温度控制在26 ℃，发酵的时间分别设为2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，实验结果如表6。

表6 不同的发酵时间对发酵结果的影响

从表中看出，随着发酵时间的延长发酵液终点的pH呈下降趋势，菌体收率从第2 d快速增加，到第3 d后几乎达到顶点不再增加，发酵液的孢子数在第4 d有一个快速的提高，随着发酵的延长孢子数逐渐提高，丝化比呈逐渐下降趋势，得出随发酵时间的延长，菌丝逐渐转化为分生孢子。

2.5 不同的原料初始pH条件对淡紫拟青霉液体发酵的影响

调节初始培养基的pH值分别为pH3、pH4、pH5、pH6、pH6.5、pH7、pH8，进行液体发酵，发酵时间为5 d，测定发酵试验结果如表7。

表7 不同原料初始pH值对发酵结果的影响

从表7中的结果得出，淡紫拟青霉菌种对pH的要求还是比较宽泛，pH偏低更有利于发酵的进行，pH6.5发酵液中的孢子数最多，丝化比最低，因此最适pH为6.5，pH5～8淡紫拟青霉菌都可以很好地生长。

2.6 不同的通气量对淡紫拟青霉液体发酵的影响

用500 mL三角瓶装入不同量的发酵液，调整发酵过程中的通气量，相同转速情况下装量越少通气效果越好，三角瓶中装入的培养基分别为25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、150 mL、175 mL、200 mL。发酵5 d时间，结果如表8。

表8 通气量对淡紫拟青霉发酵的影响

表8得出，装量越少，通气越好的发酵液中孢子数越多，发酵效果越好。通气量的大小对菌体的收率、发酵终点的pH影响不是很明显，随通气量加大菌体的收率逐渐提高，终点pH值也逐渐降低，但不明显。

3 讨论

淡紫拟青霉生防制剂产品中分生孢子的数量是衡量产品质量的一个重要指标[6-7]。而液体发酵产品中既有菌丝体，也有分生孢子，降低产品菌丝体含量并提高分生孢子的含量是我们的目的。采用液体种子接种进行发酵，可以缩短产品的发酵周期，对产品中孢子数量提高作用不明显。而提高发酵液原料中固形物的浓度并在发酵液中添加无机盐可以非常显著地提高产品中孢子的数量，浓度提高1倍，孢子数提高30%左右，添加无机盐与对照相比，提高20%左右。通过实验可以看出，培养温度高有利于发酵液中菌丝的生长，温度低有利于孢子的形成，因而采用分段控制发酵温度的方法，可以显著提高发酵液中分生孢子的数量。通过提高培养基的浓度，添加无机盐，分段控制温度，前期28 ℃，后期26 ℃等方法结合在一起，发酵液中分生孢子数同前期的对照比提高了3倍，达到1.6×109cfu/mL。同时还得出该菌对氧的需求非常大，提高通气量可以极大地提高产品中的分生孢子数。

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1 生物防治与化学防治的区别

在农作物病虫害防治上，一般采取的方法主要有化学防治和生物防治两种。

化学防治方法在一定条件下，可短期内快速消灭害虫。但是，常规化学防治的农药毒性较大，危害绿色食品的生产。长期以来，化学肥料的施用和施肥结构的不合理，造成了农业生态环境污染和破坏。化学农药的使用，在杀死害虫、除掉杂草的同时，也带来了令人担忧的问题，如化学农药严重污染水体、大气和土壤，并通过食物链进入人体，危害人群健康。由于化学农药的长期使用，一些害虫已经产生很强的抗药性，许多害虫的天敌又大量被杀灭，致使一些害虫十分猖獗。

利用生物防治病虫害，就能有效地避免上述缺点，因而具有广阔的发展前途。生物防治对环境污染小，能有效地保护天敌，发挥持续控制作用。微生物肥料就是现代生物技术在农业应用上最成功的例子。通过选育和改造有益的根际和叶面微生物，研制微生物肥料成为实现绿色农业的主要手段之一。但是生物防治手段杀虫效果较慢，其效果易受环境因素的影响，作用不如化学防治速效，且人工繁殖培养有益生物的技术难度较高，能用于大量释放的天敌昆虫种类不多，对害虫的捕食和寄生有选择性。

2 生物防治的分类

①以虫治虫技术：利用自然界有益昆虫和人工释放的昆虫来控制害虫的危害。有寄生性天敌，如寄生蜂、寄生蝇、线虫、原生动物、微孢子虫。捕食性天敌，瓢虫、草蛉、猎春、蜘蛛等。最成功的是人工释放赤眼蜂防治玉米螟技术广泛应用。

②以菌治虫技术：利用自然界微生物来消灭害虫，有细菌、真菌等。如苏云金杆菌、白僵菌、绿僵菌、颗粒体病毒、核型多角体病毒，白僵菌和苏云金杆菌应用较广。

③以菌治菌技术：利用微生物在代谢中产生的抗生素来消灭病菌，有赤霉素、春雷霉素、阿维菌素、多抗霉素等，生物抗生素农药已广泛应用。

④性信息素治虫技术：用同类昆虫的雌性激素来诱杀害虫的雄虫。有玉米螟性诱剂、小菜蛾性诱剂等。

⑤转基因抗虫抗病技术：国际、国内最流行的生物科学技术，已成功地培养出抗虫水稻、棉花、玉米、马铃薯等作物新品种，但本身还面临许多问题，有对人类的安全性、抗基因的漂移、次要害虫上升为主要害虫等方面的问题没有解决。

⑥以菌治草：利用病原微生物防治杂草的技术。美国利用炭疽菌防治水田杂草，效果很好。

⑦植物性杀虫、杀菌技术：这是新兴的技术。第一，光活化素类是利用一些植物次生物质在光照下对害虫、病菌的毒效作用，这种物质叫光活化素，用它们制成光活化农药，这是一类新型的无公害农药。第二，印楝素是一类高度氧化的柠檬酸，从印楝种子中分离出活性物质，具有杀虫成分，这是目前世界公认的理想的杀虫植物，对400余种昆虫具有拒食绝育等作用，我国已研制出0.3%印楝素乳油杀虫剂。第三，精油就是植物组织中的水蒸汽蒸馏成分，具有植物的特征气味，较高的折光率等特性，对昆虫具有引诱、杀卵、影响昆虫生长发育等作用，这也是一种新型的无公害生物农药。

⑧生化农药是以昆虫生长调节剂产品为主，随着国外新品种的引进和推广，国内有关科研单位和企业也相继研究开发了一些新品种的生化农药，如：灭霜素、菌毒杀星、氟幼灵、杀铃脲，等等。