液相适配体芯片在食源性致病菌检测中的应用

董晓琳，李志萍，陈　漫，樊洪超，王园园，夏志平，吴永魁

(军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122)



液相适配体芯片在食源性致病菌检测中的应用

董晓琳，李志萍，陈漫，樊洪超，王园园，夏志平*，吴永魁*

(军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122)

食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素，对食源性致病菌的快速和高通量检测是防止和诊断细菌性食物中毒的有效手段。液相芯片检测技术具有需样本量少、高通量等特点。经典液相芯片技术是以有机荧光染料编码的聚苯乙烯微球为载体，新型液相芯片技术是以物理学、光学等编码的基质为载体，通过制备不同配体功能化的载体，实现对同一液相环境中多种靶细菌的同时检测。适配体是一类相比蛋白类抗体特异性高、筛选获得快、化学稳定性强的核酸配体。论文针对核酸适配体分析鉴及以适配体为基础的新型液相芯片技术在食源性致病菌检测中的应用进行了综述。

适配体；液相芯片；食源性致病菌；检测

近年来，食品安全问题越来越受到人们的关注，其中由病原微生物引起的食源性疾病是食品安全中最重要的问题。因此，快速检测食源性致病菌是有效地控制和预防病原菌传播和食物中毒的重要前提。传统检测方法特异性好、灵敏度高，但往往只能针对一种细菌且所需时较长(3 d～7 d)。PCR检测方法速度快、特异性好，但易受食品中复杂基质的影响，导致出现假阴性结果。传统的ELISA技术，需样本量大[1]、检测限较高。为解决这些检测方法的劣势，液相芯片技术应运而生。液相芯片技术具有高通量、灵活性好、灵敏度高、特异性强、重复性好等优势，现在已发展并运用于多种病原微生物[2]、毒素[3]和细胞因子的检测。

液相芯片，又称为悬浮阵列，是将探针分子固定于不同编码微载体的表面，在液相环境中，每种功能化的编码载体结合特定的识别分子，再加入荧光标记的报告分子，通过悬浮液态体系中进行的生物反应，解码功能化载体的编码，识别每种结合反应，最终实现高通量生物分子的检测技术。液相芯片技术包括液相蛋白芯片技术和液相核酸芯片技术。经典液相核酸芯片技术与多重(荧光)PCR技术联合应用于多种致病菌和病毒的检测。针对多种病原菌的16 S rDNA、23 S rDNA或者细菌的特征性侵袭基因进行多重(荧光)PCR，将不同的基因特异性探针偶联于具有荧光编码的微球上，通过基因杂交实现对病原菌的检测。郭启新等[4]针对金黄色葡萄球菌23 S rDNA、志贺菌iapH、单核细胞增生李氏杆菌iap基因分别设计特异性引物和探针，建立了一种多重PCR与液相芯片技术联合应用的检测方法，检测结果显示偶联有探针的微球只与其对应的病原菌基因发生反应，特异性较高。液相芯片技术多用于蛋白、核酸等小分子的检测。近年来，也有研究应用液相蛋白芯片技术检测病原菌(大分子)。通过制备抗体功能化微球，将其与目标菌孵育结合后，加入修饰有荧光标签的检测抗体，最后分析报告分子的荧光强度，实现对目标细菌的检测[5-6]。

经典液相芯片技术来源于Luminex和BD公司，其核心技术是使用有机荧光染料编码的微载体去识别不同的生物分子。目前报道了许多微球的编码技术，包括光学编码、物理编码(如以荧光寿命编码[7]、载体大小编码[8])、化学编码和电学编码。不同编码技术的联合运用产生了更多种类编码的微载体[9]，进而衍生出很多新型的液相芯片检测手段。新型液相芯片技术突破了仅且只能依靠流式细胞仪对载体和报告分子进行解码和分析的技术限制，使得解码设备更加多样，报告分子的选择更加丰富。

适配体于1990年首次报道[10]，是一类短的单链寡核苷酸，可以通过体外筛选得到，其折叠形成的空间构象可以高亲和力、特异性的与蛋白质、小分子和细菌结合[2-4]。适配体相比抗体而言，具有许多优势，其制备过程简单，不易受环境影响(pH、温度、化学试剂)，能经受构象的改变再次使用，易于保存和修饰，从而便于结合其他电化学或光学方法进行微生物检测、药物治疗等[11-13]。

近年来，以适配体为基础构建新型液相芯片技术，已逐步引起研究学者的关注。论文就适配体的特异性、亲和力鉴定方法，以及基于几种常见的光学编码的液相芯片检测方法做一综述。

1　适配体筛选与鉴定

1.1核酸适配体

核酸适配体是由指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选获得。首先体外合成一单链寡核苷酸库(ssDNA或ssRNA)，文库两端为固定碱基序列，中间为随机序列，库容量约为1020～1030。将该随机文库与靶物质混合孵育后，通过离心或者其他技术手段分离得到核酸与靶物质的复合物，将此核酸进行PCR扩增进行下一轮筛选，一般通过8轮～15轮的筛选和扩增获得候选适配体序列，最后通过生物信息学分析、亲和力测定获得一条或者几条能高特异性、高亲和力结合靶物质的适配体。

1.2核酸适配体鉴定

核酸适配体鉴定研究是获得高亲和力、高特异性适配体的关键，通过对每轮的核酸序列亲和力测定以确定最佳筛选轮数，监测筛选过程，减少不必要的筛选时间和人力。对适配体候选序列进行亲和力测定，最终确定一条或几条高特异性、高亲和力适配体。

由完整细胞为靶分子进行的亲和力测定方法包括流式细胞术测定法、荧光定量PCR[14]、放射性同位素标记法[15]等。除此之外，还有一些新的亲和力测定技术如毛细管电泳技术等可用于评估微生物或蛋白与适配体候选序列的亲和力。

流式细胞术是分析细胞与适配体候选序列亲和力的常用手段，通过在适配体候选序列的一端标记荧光分子，然后与细胞孵育、洗涤后分析单个细胞，通过计算结合上标记荧光适配体的细胞阳性率来评估候选序列与靶细胞的结合力，从而监测整个筛选过程。Moon J等[16]利用FACS-SELEX(fluorescence activated cell sorting)，经过10轮筛选获得了针对金黄色葡萄球菌高亲和力与特异性适配体A14，并使用流式细胞术测定，其解离常数为3.49 nM±1.43 nM。

亲和毛细管电泳是根据靶分子和配体的浓度变化及靶分子-配体复合物的迁移率变化表征复合物的形成或解离。以aptamer为亲和探针，利用其与靶分子在电泳前或电泳过程中的亲和作用，可定量分析靶分子以及测定亲和常数。自从German I等[17]将毛细管电泳技术应用于适配体与其靶分子的亲和力研究以后，在世界范围内掀起了一股CE-SELEX(capillary electrophoresis，CE)的研究热潮，但是关于利用毛细管电泳技术测定完整细菌分子与适配体亲和力方面的报道很少。Stratis-Cullum D N等[18]首次使用毛细管电泳评估空肠弯曲菌适配体的特异性和亲和性，并证明该适配体与其他食源性致病菌如鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌O157:H7没有明显的位移和峰型变化。

2　基于适配体构建的新型液相芯片检测方法

2.1以量子点编码载体为基础的液相芯片技术

量子点(quantum dot，QD)是由有限数目的半导体材料(通常由ⅡB～ⅥB或ⅢB～ⅤB元素组成)制成，量子点的典型尺寸在10 nm～50 nm之间。量子点具有独特的光学特性，具有分子特性的分立能级结构，可以在小于其发射波长的任何波长下被激发，且发射波长范围极短(半峰宽约为20 nm～30 nm)，发射峰对称。在同一波长下激发多个量子点，得到多个不同发射峰的量子点的谱带，基于量子点的不同荧光颜色和荧光强度进行荧光编码，从而可以作为多色标记物应用于多组分的分析研究。将不同靶物质的特异性配体偶联于不同荧光颜色的量子点表面，可实现同一液相环境中多种病原菌的检测。Duan N等[19]将鼠伤寒沙门菌适配体和副溶血性弧菌适配体分别固定于发射波长为535 nm和585 nm的量子点，通过流式细胞术检测绿色荧光通道和橙色荧光通道的阳性区域的细菌数百分比，实现同时识别副溶性血弧菌和鼠伤寒沙门菌的目的，检测特异性高且结果可靠。量子点编码的载体易被流式细胞仪或者荧光分光光度计解码。由于流式细胞仪也可根据微载体大小进行解码，许多学者通过将不同荧光颜色和荧光强度编码的量子点与不同大小的微球结合，从而产生更多的编码。在流式细胞仪的分析图FLn-FLm-FS(n和m分别表示不同的荧光通道)将会生成一种三维空间的编码库。

2.2以上转换荧光纳米颗粒为基础的液相芯片技术

上转换荧光纳米颗粒(upconversion fluorescent nanoparticles，UCNPs)一般是通过在基质(一般为氟化物)中掺入稀土离子(发光离子)和敏化离子(提高上转换效率)形成。上转换纳米材料由近红外线(near infrared ray，NIR)波长激发(一般为980 nm)，发射出短波长、高频率的光。UCNPs发射谱带窄，通过掺入镧系元素的比例不同(Er3+、Tm3+、Ho3+)，调节发射的荧光颜色。除此之外，上转换纳米颗粒之间不会产生荧光能量共振转移，是作为微球编码的最佳荧光物质。Wu S等[20]通过掺入不同的稀土离子分别制备了3种不同荧光发射峰的UNCPs，将金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门菌适配体偶联于多色UNCPs作为分子识别配件，与偶联适配体互补序列的磁珠结合后，检测目标细菌。当样本体系中含有目标细菌时，功能化UNCPs特异性捕获靶细菌，从互补序列的磁珠上解离下来，使用980 nm激光器解码分析磁珠上的UNCPs发射峰和强度，进而达到鉴别细菌的目的。

2.3以SERS光学编码载体为基础的液相芯片技术

表面增强拉曼(surface enhanced raman scattering，SERS)是一个通过依赖生物成像产生光学信号，进而实现检测的生物传感器，主要依靠等离子共振材料，比如重金属(银、金、铜)等具有纳米特性的物质(粗糙的表面和纳米颗粒)实现拉曼光谱的增强。在先前的报道中，一些纳米材料，如石墨烯、TiO2、QDs均具有SERS特性。在液相芯片技术中，SERS信号分子通常作为一种标记分子修饰在微载体上。2007年，Doering W E等[21]推出Nanoplex技术，NanoplexTMbiotag是将标记有拉曼信号分子的纳米颗粒包裹于二氧化硅壳之下，拉曼信号分子的拉曼峰作为一种编码，广泛应用于多种检测实验中。Zhang H等[22]将金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌的特异性适配体分别结合在修饰有拉曼信号分子5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB]和对巯基苯甲酸(mercaptobenzoic acid，MBA)纳米金表面，并制备两种适配体共同功能化的Fe3O4@Ag 纳米颗粒，将功能化的纳米金颗粒、Fe3O4@Ag 纳米颗粒与靶细菌共同孵育结合，磁性分离后，利用拉曼光谱仪分析DNTB和MBA的拉曼信号，实现液相环境中细菌的双重检测。

2.4其他

随着液相芯片技术的发展和应用，许多学者将微载体的合成及修饰作为构建多重生物分子检测技术的重要环节。Ye B F等[23]通过制备不同形状、不同结构色的水凝胶晶体，构建了以适配体为基础的新型多重检测技术，研究中发现由于光子晶体自身结构形成的多个表面空隙导致强烈的非特异性吸附，利用琼脂糖凝胶具有良好的生物相容性这一特征，将其包裹于光子晶体表面，结果发现这样可以有效封堵微球空隙，提高了功能化光子晶体与靶物质的结合动力学。Wang L等[24]构建食源性致病菌的多重检测方法时，将聚乙二醇修饰于磁珠表面，通过增加磁珠的水溶性和增长抗体与磁珠之间的距离从而降低位阻效应，促进反应进行，并且研究发现直接将抗体偶联于磁珠表面不能较好的检测细菌。此外，制定不同模式的信号扩增法提高多重检测系统的灵敏度、建立以磁性微载体为基础的自动化多重检测平台等正不断促进液相芯片技术的发展。

3　小结和展望

液相芯片以其操作简便、高灵敏度、高通量以及宽的线性测定范围等优点，广泛应用于多个领域。经典液相芯片技术利用流式细胞术解析荧光编码的微球，分析报告分子的荧光强度，进而实现对目标分析物的定性和定量分析。新型液相芯片技术的出现，打破了仅依靠流式细胞仪分析鉴定的局限，但所需分析设备存在解码速度慢、价格昂贵、需要专业人员操作等缺点。在经典的多重检测技术中，生物标签、分析物和偶联有捕获配体的微载体组成类似夹心酶联免疫试验的复合物，通过分析微载体和生物标签实现检测。新型液相芯片技术通常包括偶联有生物标签的捕获配体和分析物，通过使用相关仪器对生物标签进行分析、解码，便可实现分析物的检测。方法更加便捷、快速，但对捕获配体的特异性、亲和力要求更加苛刻。此外，构建多重液相芯片检测手段时，还需要花费大量的时间和劳动力，进行配体筛选和功能化载体特异性鉴定工作，以保证功能化载体之间互不干扰，无交叉反应，结果更加稳定、可靠。因此，在构建以适配体为基础液相芯片检测技术时，制定高效率的筛选方法、鉴定手段，获得更多种类的高特异性适配体具有重要意义。相信随着科学技术的不断发展，通过对适配体筛选技术及鉴定技术的不断优化，液相芯片技术研究的不断深入，以适配体为基础构建的液相芯片检测平台将在食源性致病菌检测领域发挥更加重要的作用。

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Application of Aptamer-based Suspension Array in Detection of Food-borne Pathogens

DONG Xiao-lin,LI Zhi-ping,CHEN Man,FAN Hong-chao,WANG Yuan-yuan,XIA Zhi-ping,WU Yong-kui

(Institute of Veterinary Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Key Laboratory of Jilin Province forZoonosisPreventionandControl,Changchun,Jilin,130122,China)

Food-borne pathogens are important factors to cause food poisoning,rapid detection of food-borne pathogens are effective means of prevention and diagnosis of bacterial food poisoning.Suspension array technology is a fast,high-throughput detection method.Classic liquid chip technology is based on the organic fluorescent dye-coded polystyrene microspheres as a carrier,while the new-type suspension array technology is based on physics and optical coding matrix as the carrier,through preparing several different ligands functionalized carriers,the multiplex detections of target bacteria in one liquid environment were achieved.Aptamer have many advantages over antibody in aspects of specificity,rapid screening progress and strong chemical stability.In this article,aptamers identification methods and applications of aptamer-based chip technology in food-borne pathogen detection were reviewed.

aptamer;suspension array;food-borne pathogens;detection

2016-02-29

武汉东湖新技术开发区3551光谷人才计划(第7批)

董晓琳(1990-)，女，河北邢台人，硕士研究生，主要从事基础兽医学研究。*通讯作者

S852.61

A

1007-5038(2016)08-0104-04