分析反相高效液相色谱法测定注射用苯唑西林钠的有关物质

王利勇

哈药集团制药总厂质量检验中心 黑龙江哈尔滨 150000

分析反相高效液相色谱法测定注射用苯唑西林钠的有关物质

王利勇

哈药集团制药总厂质量检验中心 黑龙江哈尔滨 150000

医学技术的不断发展，各类色谱技术不断完善，反相高效液相色谱法具有良好的选择性和稳定性，被广泛应用，本文将利用反相高效液相色谱法对苯唑西林钠有关物质进行测定。

反相高效液相色谱法；苯唑西林钠；有关物质

一、反相高效液相色谱简介

反相高效液相色谱在液液色谱的基础上发展而来的，是化学键合相色谱的一种，它的产生是为了防止固体液在分离过程中流失。由于其良好的选择性，在众多新色谱技术中脱颖而出，应用范围不断扩大，应用前景广阔。其中键合相色谱法是通过将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。化学键合固定相具有良好的稳定性和选择性，其制备的色谱柱具有使用寿命长，重现性好的特点，被广泛应用。

二、苯唑西林钠简介

苯唑西林钠为半合成的耐酸、耐酶的异唑类青霉素。它是白色粉末或结晶性粉末；无臭或微臭。在水中易溶，在丙酮或丁醇中极微溶解，在醋酸乙酯或石油醚中几乎不溶。2%水溶液的pH值为 5.0-7.0，不受青霉素酶水解，对产酶金黄色葡萄球菌菌株有效，MIC为0.4µg/mL。同其他β-内酰胺类抗生素一样，与氨基糖苷类抗生素混合后，可明显减弱两者的抗菌活性。苯唑西林钠及其制剂的有关物质测定，国内外的研究资料较少，中国药典2010年版二部采用相对保留时间对其中的特殊杂质进行定位，但误差较大，加之色谱系统的耐用性差，导致测定结果不准确。

三、测定前的准备工作

由于苯唑西林钠容易受到酸、碱、氧化、光照、温度的影响，所以应严格按照规定进行正确储藏并注意保质期。备齐以下测定所需用品：注射用苯唑西林钠、乙腈、醋酸铵、醋酸、2695 Aliance高效液相色谱仪（美国 Waters公司，主要配备四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器）、电子天平、实验室制备的超纯水。

四、方法与结果

1、色谱条件

色谱柱：Thermo gold C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：0.01 mol·L-1醋酸铵溶液（醋酸调pH至5.0）-乙腈（75∶25）；流速：1 mL·min-1；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：225nm。

2、检测波长的选择

准确称取注射用苯唑西林钠，制成1 mg·mL-1的溶液，用二极管阵列检测器在400—200nm处扫描，发现苯唑西林钠和其主要杂质均在在 225nm附近波长有最大吸收，可以确定 225nm是有关物质的检测波长。

3、色谱条件的选择与优化

（1）溶液的制备

称取25.16 mg的注射用苯唑西林钠，放置在25 mL量瓶中稀释。

（2）流动相pH值的确定

用醋酸和三乙胺调节不同pH值的流动相进行试验，结果表明在pH值为5.0时，峰的对称性最好。

（3）缓冲盐浓度的确定

配制不同浓度的醋酸铵溶液作为流动相的水相进行试验，结果表明在浓度为0.01 mol· L-1时，杂质的分离度与对称性最好。

4、方法的专属性考察

（1）酸破坏

称取注射用苯唑西林钠约25 mg，置于25 mL量瓶中，加1 mol·L-1盐酸10 mL溶解后，放置1 h，调节pH值至7.0，再加流动相稀释至刻度。

（2）碱破坏

取25 mL 量瓶，将25mg注射用苯唑西林钠放入，加入2 mL L-1氢氧化钠溶液溶解，放置三分钟后，将PH值调节为7.0，加流动相稀释至刻度。

（3）氧化破坏

取25 mL 量瓶，将25mg注射用苯唑西林钠放入，加入2 mL 3%过氧化氢溶液溶解，放置两小时后，将PH值调节为7.0，加流动相稀释至刻度。

（4）热破坏

称取注射用苯唑西林钠约 25 mg ， 置于25 mL 量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度， 70 ℃水浴中加热2 h，放冷至室温。

（5）光照破坏

称取注射用苯唑西林钠约25 mg，置于25 mL量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，用3 000～4000Lx光照射10d。取上述溶液各10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明各个峰之间均能较好地分离。

5、线性关系

精密称取注射用苯唑西林钠58.57 mg置50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取2.5 mL置100mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1、2、4、6、10、12和24 mL各置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以供试液浓度C（μg·mL-1）为横坐标，峰面积A 为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：A =5.238 ×104C+4.182 ×103，r =0.999 8，表明苯唑西林钠浓度在1.171～28.11μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

6、检测限和定量限

精密称取注射用苯唑西林钠适量，用流动相适量使溶解后，进一步稀释成不同浓度的2份，1份用流动相稀释成最终浓度含苯唑西林钠为0.036μg·mL-1、另1份稀释成最终浓度含苯唑西林钠为0.36μg·mL-1的系列溶液，分别取该两系列溶液按上述色谱条件测定，记录色谱图，并对色谱系统进行基线检测，结果苯唑西林钠检测限浓度为0.036μg·mL-1（S/ N =3），定量限浓度为0.18μg·mL-1（S/ N =10）。

7、重复性试验

精密称取注射用苯唑西林钠约25mg，共6份，分别置25mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以苯唑西林钠浓度与峰面积的比值计算，RSD为0.27%（n=6），表明重复性良好。

8、精密度试验

精密称取注射用苯唑西林钠约25 mg，置25 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10μL，注入高效液相色谱仪，重复6次，分别记录色谱图，以苯唑西林钠浓度与峰面积的比值计算，RSD为0.12%（n=6），表明精密度良好。

9、耐用性试验

分别用Therom gold C18（4.6 mm ×250 mm，5μm）、Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）及依利特C18（4.6 mm×200 mm，5μm）3种色谱柱对注射用苯唑西林钠中有关物质进行测定，记录的色谱图峰形均良好，理论板数按苯唑西林钠峰计均为＞3000，苯唑西林钠峰与相邻的峰的分离度均＞1.5，耐用性好。

10、样品测定

精密称取注射用苯唑西林钠约25 mg，置25 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照溶液。按上述色谱条件分别精密量取10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。最大单个杂质为0.2%，总杂质为1.0%。

总结：通过反相高效液相色谱法对注射用苯唑西林钠的检测发现，在本色谱的条件下能够实现较好的分离，杂质相对的检出率较高，表明反相高效液相色谱法具有基线稳定，重现性好，分析速度快、准确度高的特点，并可同时测定有关物质的含量及特点，在天然药物、复方成药、抗生素等药物的分析方面都有着广阔的应用前景。

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R927.2

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1672-5018（2016）10-266-02