GSK-3β抑制剂LiCl干预大鼠重症急性胰腺炎的量效关系

陈辰，赵凯亮，邓文宏，余佳，郭闻一，张大兴，王卫星

(武汉大学人民医院肝胆腔镜外科消化系统疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 4300600)

GSK-3β抑制剂LiCl干预大鼠重症急性胰腺炎的量效关系

陈辰，赵凯亮，邓文宏，余佳，郭闻一，张大兴，王卫星

(武汉大学人民医院肝胆腔镜外科消化系统疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 4300600)

目的 探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂氯化锂(LiCl)干预大鼠重症急性胰腺炎(SAP)的量效关系。方法50只SPF级雄性Wistar大鼠，按数字表法随机分为五组(n=10)：假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)、LiCl-40 mg/kg组、60 mg/kg组和80 mg/kg预处理组(LiCl组)。胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1 mL/100 g)制备SAP大鼠模型；SO组在胆胰管内注射等量生理盐水替代牛磺胆酸钠。LiCl组造模前30 min经股静脉注射相应浓度LiCl。术后12 h分批处死大鼠，检测血清淀粉酶(AMY)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、腹水量和肺湿干比。光镜下观察胰腺组织病理学变化并进行病理学评分。结果SAP组大鼠AMY、ALT、Cr、腹水量、肺湿干比、胰腺病理评分均较SO组升高[(7 224.14±1872.41)U/L vs(1 780.21±231.12)U/L、(250.56±51.56)U/L vs (98.45±10.36)U/L、(85±19)U/L vs(36±4)U/L、(11.05±2.76)g vs(0.33±0.04)g、(3.21±0.61)vs(1.60±0.20)、(11.52±1.23)分vs(0.54±0.02)分]，差异均有统计学意义(P＜0.05)；LiCl 60 mg/kg组上述指标与SAP组相比较均有下降[(4 215.36± 940.24)U/Lvs(7 224.14±1872.41)U/L、(160.25±35.39)U/Lvs(250.56±51.56)U/L、(50±11)U/Lvs(85±19)U/L、(6.04±1.03)g vs(11.05±2.76)g、(2.70±0.54)vs(3.21±0.61)、(9.03±1.09)分vs(11.52±1.23)分]，差异均有统计学意义(P＜0.05)；而LiCl 40 mg/kg组AMY、腹水量、肺湿干比以及胰腺病理评分与SAP组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；LiCl-80 mg/kg组大鼠的ALT升高大于SAP组[(312.47±69.41)U/L vs(250.56±51.56)U/L]，差异有统计学意义(P＜0.05)，Cr水平与SAP组比较[(79±17)U/L vs(85±19)U/L]差异无统计学意义(P＞0.05)。结论LiCl-60 mg/kg是干预重症急性胰腺炎大鼠模型最佳有效剂量。

Wistar大鼠；重症急性胰腺炎；氯化锂；剂量-效应关系

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是临床上常见的急腹症之一，约有20%的患者进展为重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)，伴有胰腺和胰外脏器的损伤，致死率较高[1-2]。糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)主要参与机体糖原合成过程；除此之外，GSK-3β还可参与机体炎症反应过程[3]，其作为炎症干预靶点逐步受到重视。氯化锂(LiCl)作为GSK-3β抑制剂，在大鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型中的使用方法与剂量报道较少。本研究旨在探讨静脉给予LiCl干预大鼠SAP模型的量效关系。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 LiCl选用Kingherb’s公司产品，使用10%DMSO(Sigma公司)溶解；牛磺胆酸钠(STC)选用Sigma公司产品，使用无菌生理盐水溶解。水合氯醛由武汉大学人民医院药剂科提供，生理盐水溶解，配置浓度10%。

1.2 动物模型制备和实验分组 雄性SPF级Wistar大鼠50只，平均体重200～250 g，购自湖北省疾病预防控制中心。使用数字表法进行随机化分组，共5组(n=10)：假手术组(SO组)；重症急性胰腺炎组(SAP组)；LiCl 40 mg/kg组、60 mg/kg组和80 mg/kg预处理组(LiCl组)。大鼠术前12 h禁食不禁水处理。重症急性胰腺炎(SAP)造模使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉法麻醉(0.3 mL/100 g)。常规大鼠腹部消毒铺巾，剑突下0.5 cm正中切口入腹，于肝脏下缘深部寻找十二指肠，穿刺针逆行经十二指肠乳头部入主胰管，注射STC溶液(浓度5%，0.1 mL/100 g，0.1 mL/min恒速)，注射后确认胰腺组织出现明显水肿及出血可认为造模完成；假手术组(SO组)使用相同手法向胰腺注射等量生理盐水。LiCl干预组于造模前30 min股静脉注射法给予相应剂量的LiCl溶液。造模后12 h分批处死大鼠，负压下腔静脉采血，离心血清备用。胰头固定切片，右肺下叶测定湿干比，棉球复称法测定腹水量。

1.3 指标检测 使用干棉球吸取腹水，复称湿重减去干重即为腹水量。右肺下叶烤箱烘烤24 h后干重，肺湿干比(W/D)=肺湿重/肺干重。血清淀粉酶(AMY)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)均使用武汉大学人民医院检验科全自动生化仪检测。胰腺病理切片光镜下参照Schmidt J[4]标准进行病理评分。

1.4 统计学方法 应用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，多组间计量数据采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清AMY、ALT、Cr的变化 与SO组比较，SAP组AMY、ALT、Cr水平均明显升高(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg组干预后，其AMY水平与SAP组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；而LiCl 60 mg/kg组和80 mg/kg组AMY水平对比SAP组明显下降(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg组和60 mg/kg组ALT水平与SAP组比较明显降低(P＜0.05)，而LiCl 80 mg/kg组ALT水平甚至高于SAP组(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg组和60 mg/kg组Cr水平与SAP组比较下降(P＜0.05)，LiCl 80 mg/kg组Cr水平与SAP组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清AMY、ALT及Cr水平(±s)

表1 各组大鼠血清AMY、ALT及Cr水平(±s)

注：与SO组比较，aP＜0.05；与SAP组比较，bP＜0.05。

组别AMY（U/L）ALT(U/L)Cr(U/L) SO组SAP组LiCl-40 mg/kg组LiCl-60 mg/kg组LiCl-80 mg/kg组F值P值1780.21±231.12 7224.14±1872.41a7006.15±1610.31a4215.36±940.24ab4008.36±920.65ab44.15 .000 98.45±10.36 250.56±51.56a120.12±26.36b160.25±35.39ab312.47±69.41ab28.70 .000 36±4 85±19a40±9b50±11ab79±17a16.52 .000

2.2 各组大鼠腹水量、W/D、胰腺病理评分的变化 与SO组比较，SAP组腹水量明显增加、W/D明显升高(P＜0.05)。LiCl 40 mg/kg组干预后腹水量和W/D与SAP组比较均无统计学意义(P＞0.05)；而LiCl 60 mg/kg组、80 mg/kg组干预后上述指标均较SAP组明显降低(P＜0.05)。与SAP组比较，LiCl 40 mg/kg组病理评分无明显改变，而LiCl 60 mg/kg、80 mg/kg组干预后病理评分显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。SO组胰腺结构大致正常；SAP组胰腺可见片状坏死、间质出血、腺叶间隙增宽及炎症细胞浸润；LiCl干预后上述病理改变有所缓解，见图1。

表2 各组大鼠腹水量、W/D、胰腺病理评分的变化(±s)

表2 各组大鼠腹水量、W/D、胰腺病理评分的变化(±s)

注：与SO组比较，aP＜0.05；与SAP组比较，bP＜0.05。

组别 腹水量(g)W/D 胰腺病理评分SO组SAP组LiCl-40mg/kg组LiCl-60mg/kg组LiCl-80mg/kg组F值P值0.33±0.04 11.05±2.76a10.08±2.41a6.04±1.03ab6.60±1.65ab74.09 .000 1.60±0.20 3.21±0.61a2.80±0.56a2.70±0.54ab1.90±0.38b16.69 .000 0.54±0.02 11.52±1.23a10.81±2.01a9.03±1.09ab6.36±0.09ab75.27 .000

图1 各组大鼠胰腺组织12 h病理改变(HE×400)

3 讨 论

目前，锂盐在临床上主要用于治疗精神疾病，例如治疗躁狂症、双相情感障碍、抑郁症等[5]；但是近期的研究发现，锂盐还能发挥其他多种作用，例如在创伤性脑损伤(TBI)模型中，锂盐可以通过抑制GSK-3β、上调神经营养因子和生长因子表达、下调促凋亡因子、调节炎症细胞功能等多种途径，发挥神经保护作用[6-7]。在肝脏和肾脏的缺血再灌注模型中，氯化锂可通过减少细胞凋亡、抗氧化应激等途径，发挥细胞保护作用[8-9]。因此，氯化锂的这种“多靶点效应”逐渐被人们关注，在多种疾病模型中被不断深入研究。

GSK-3β主要参与机体糖原合成过程，随着对其研究的深入，人们发现GSK-3β还参与神经保护、抑制肿瘤细胞凋亡、抑制炎症反应过程等过程[10]。有学者报道GSK-3β抑制剂TDZD-8可通过下调核因子-κB (NF-κB)和白介素-1(IL-1)的表达，缓解由蛙皮素诱导的急性胰腺炎胰腺组织损伤[11]。因此，我们推测氯化锂作为GSK-3β的抑制剂，也可能对急性胰腺炎的损伤有保护作用，但其干预的剂量文献报道较少。为此，本文主要探讨氯化锂干预急性胰腺炎模型的量效关系，为下一步深入研究其具体作用机制提供依据。

我们参考相关文献剂量[12]，在本研究中设立了40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg三个剂量梯度。结果显示与SAP组比较，低剂量氯化锂(40 mg/kg)未能有效改善胰腺损伤的病情；中高剂量氯化锂(60 mg/kg、80 mg/kg)能显著降低血清AMY水平和胰腺损伤的病理评分。进一步分析显示过高剂量的氯化锂(80 mg/kg)干预，可导致肝肾功能的损伤，表现为ALT和Cr水平升高，其中ALT甚至高于SAP组。而中等剂量氯化锂(60 mg/kg)干预后可以降低ALT和Cr水平、减少腹水量，降低肺湿干比，与SAP组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。依据上述结果，我们认为静脉注射氯化锂60 mg/kg后，可有效缓解重症急性胰腺炎胰腺损伤，减少腹水量、降低肺湿干比，该剂量是干预SAP大鼠模型的最佳有效剂量。

[1]中华医学会外科学分会胰腺外科学组.急性胰腺炎诊治指南(2014) [J].中国实用外科杂志,2015,35(1):4-7.

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Dose-effect relationship of LiCl,an inhibitor of GSK-3β,on severe acute pancreatitis in rats.

CHEN Chen,ZHAO Kai-liang,DENG Wen-hong,YU Jia,GUO Wen-yi,ZHANG Da-xing,WANG Wei-xing.Department of Hepatobiliary and Laparoscopic Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Key Laboratory of Hubei Province for Digestive System Diseases, Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate dose-effect relationship of LiCl,an inhibitor of GSK-3β,on severe acute pancreatitis in rats.MethodsFifty male Wistar rats were randomly divided into 5 groups(n=10)by digital table method:sham operation group(SO group),severe acute pancreatitis model group(SAP group),different dosage LiCl pretreatment groups(40 mg/kg,60 mg/kg and 80 mg/kg).SAP model was induced by retrograde infusion of 5%sodium taurocholate(0.1 ml/100 g)into the biliopancreatic duct.In SO group,the same amount of normal saline(NS)was infused into bilio-pancreatic duct instead of sodium taurocholate.Various doses(40 mg/kg,60 mg/kg and 80 mg/kg)of LiCl solution were administered via femoral vein 30 min before the SAP induction in LiCI pretreatment groups.Rats were killed at 12 h after operation,and the levels of serum amylase(AMY),alanine transarninase(ALT),creatinine(Cr),ascites, lung wet/dry weight ratio were measured in all groups.Pancreatic tissue was observed under the light microscope and pathological score was evaluated.ResultsThe levels of AMY,ALT,Cr,ascites,lung wet/dry weight ratio,and pancreatic pathological score in SAP group were significantly higher than SO group(7224.14±1872.41)vs(1780.21±231.12)U/L, (250.56±51.56)vs(98.45±10.36)U/L,(85±19)vs(36±4)U/L,(11.05±2.76)vs(0.33±0.04)g,(3.21±0.61)vs(1.60±0.20), (11.52±1.23)vs(0.54±0.02)(P＜0.05).Compared with SAP group,60 mg/kg dosage of LiCl had the best effect on improving all the indexes(4215.36±940.24)vs(7224.14±1872.41)U/L,(160.25±35.39)vs(250.56±51.56)U/L,(50±11)vs(85±19)U/ L,(6.04±1.03)vs(11.05±2.76)g,(2.70±0.54)vs(3.21±0.61),9.03±1.09 vs 11.52±1.23)(P＜0.05),while 40 mg/kg dosage of LiCl failed to improve some indexes(AMY,ascites,lung wet/dry weight ratio,pathological score)(P＞0.05).However,ALT level of LiCl-80 mg/kg group was higher than SAP group(312.47±69.41 vs 250.56±51.56 U/L)(P＜0.05),and there was no significant difference of Cr level between the two groups(79±17)vs(85±19)U/L(P＞0.05).ConclusionLiCl(60 mg/kg)administered intravenously was the optimal and effective dosage for attenuating the severity of severe acute pancreatitis.

Wistar rat;SevereAcute Pancreatitis;LiCl;Dose-response Relationship

R-332

A

1003—6350（2016）09—1380—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.002

2015-12-21)

中央高校基本科研业务费专项资金(编号2042015kf0086)

王卫星。E-mail：sate.llite@163.com