重庆地区特异性分枝杆菌噬菌体的分离与裂解肽效能研究

谭剀心邹俣希

重庆地区特异性分枝杆菌噬菌体的分离与裂解肽效能研究

谭剀心邹俣希

分离新的分枝杆菌噬菌体，研究其生物学特性，以及裂解酶，将有助于控制分枝杆菌在环境中的传播，丰富对噬菌体多样性的认识。噬菌体的裂解性肽段可以与其他化合物分子耦合，成为双功能分子，如与抗疟疾的青蒿素结合，可同时杀灭分枝杆菌和疟原虫。

实验方法

噬菌体分离纯化。分别取5份土样10g，加入15ml MP buffer、30μl Amp（50mg/ml）和1ml 新鲜培养的耻垢分枝杆菌悬浊液，混匀。于37℃，160r/min培养过夜。

分别取三份污水样品300μl，加入新鲜培养的耻垢分枝杆菌宿主菌悬液1mL，LB液体培养基35ml， MP buffer15ml，Amp（50mg/ml）30μl加 CaCl2至终浓度1mmol/L，置37℃，160r/min培养过夜。

取培养过夜样品12000r/min离心6min，取上清用0.22μm过滤器过滤除菌。将滤液进行倍比稀释。取1ml耻垢分枝杆菌悬浊液，与3ml滤液混合静置15min。取2ml宿主菌-噬菌体悬液，再加入4ml水琼脂（ 0.7%的琼脂,1mM CaCl2），加入Middlebrook的7H10/ Amp平板上，37℃培养过夜。观察噬菌斑形成情况。噬菌斑形成时，挑取透明单个噬菌斑接种至宿主菌培养液中进行扩增，经3～5次反复纯化后得形状大小一致的噬菌斑。

噬菌体一步生长曲线。培养200ml耻垢分枝杆菌（含20%Tween80）至OD600达到0.6～0.8。用新鲜7H9

培养基（无Tween80）洗菌体3遍，去除Tween80。在菌液中加入噬菌体，使其MOI达到10。混匀后，37℃温育30min。13000 r/min离心30s，取上清，用MP buffer重悬，置于37℃摇床，110r/min震荡培养。从40min起每隔45min取样50ul，13000 r/min离心30s。取上清，倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体滴度。重复实验3次，绘制一步生长曲线。

噬菌体裂解效能实验。采用平板法测定污水中总菌数。分别取一份污水样品10ml，13000r/min离心5min，加入噬菌体悬液1ml，混合5min后倍比稀释8倍，取不同稀释度的混合液1ml，涂布于7H9固体平板陪养过夜，计算总菌数。做3个平行。

分枝杆菌噬菌体SWU1 lysin基因系统发育树构建。选取西南大学已完成测序工作的分枝杆菌噬菌体SWU1，学习裂解基因的亲缘关系比对方法及构建系统发育树。登陆NCBI，用Blast软件将lysin裂解基因序列与GenBank中已有的序列进行比对，用MEGA6构建系统发育树。

结果与讨论

分枝杆菌噬菌体分离。分离到一种噬菌体ZT，噬菌斑的大小。

噬菌体ZT一步生长曲线。将约2×103PFU/mL的噬菌体与约2×102cfu/ mL的宿主菌混合培养，从40min开始取样，稀释9个梯度涂板。以时间为横坐标，以噬菌体滴度为纵坐标作噬菌体ZT的一步生长曲线图(图1)，噬菌体ZT感染宿主菌的潜伏期为220 min 左右，爆发时间为180 min 左右，爆发量为4.5×103（噬菌体终滴度9×103PFU/mL）/（菌液初始浓度2×102cfu/mL）。

分枝杆菌噬菌体ZT裂解效能实验结果。实验可看到噬菌体对三个平行污水样品中的菌体，都有明显得裂解效果，菌株数目均有大幅减少。

lysin基因系统发育树分析。在GenBank中选取比对出与分枝杆菌噬菌体Mycobacteriophage SWU1的lysinA 基因序列相似度较高的18种噬菌体基因序列，选取与分支杆菌噬菌体Mycobacteriophage SWU1的lysinB 基因序列相似度较高的20种噬菌体基因序列。从分枝杆菌噬菌体SWU1 Lysin A基因的系统发育树以及分枝杆菌噬菌体SWU1 Lysin B基因的系统发育树可看出Mycobacteriophage SWU1 Lysin A基因与Mycobacterium phage Chy4,Mycobacterium phage Chy5的同源性达到了98%，Mycobacteriophage SWU1 Lysin B基因与Mycobacterium phage Chy4的同源性达99%，可以推测Mycobacteriophage SWU1与Mycobacterium phage Chy4有较近的亲缘关系。

应用实践及展望

本项目成功从重庆地区环境污水中分离得到一种分枝杆菌噬菌体，对其生理特性及分枝杆菌的主要裂解基因lysin基因的亲缘关系进行了研究，为寻找具有地区特异性的分枝杆菌噬菌体，探究噬菌体之间的亲缘关系以及其与宿主菌之间的作用机制提供线索。还可以利用噬菌体的高效裂解性和专一性，治理污水中分枝杆菌造成的环境污染。并将在后续试验中将噬菌体的裂解性肽段与其他化合物分子耦合，成为双功能分子，开发噬菌体的综合效能。

由于实验的偶然性和时间关系，裂解肽的工作正在进行中。在现有实验结果基础上，预期我们的下一阶段工作会开创一个崭新的领域。

（作者单位：西南大学附属中学校；指导教师： 宋洁）