拟南芥总RNA的提取及RT—PCR扩增CBF1基因

熊结标

摘 要：CBF1基因的扩增是研究植物抗旱基因的前期工作。本研究用Trizol试剂法提取模式植物拟南芥叶片的总RNA，经过反转录进行PCR扩增，将产物DNA回收后，连接PCR片段与T载体，电击转化入E. coli大肠杆菌感受态细胞；涂平板长出菌落，挑取半个白斑菌落电泳鉴定转化子；鉴定完成后提取质粒，用双酶切法进行鉴定，结果表明获得CBF1基因。

关键词：拟南芥 RNA 抗旱基因 CBF1

拟南芥（Arabidopsis thaliana）：十字花科，两年生草本，高7厘米～40厘米，广泛用于植物遗传学、发育生物学等研究，已成为一种典型的模式植物。其原因主要基于该植物具有以下特点：植株个体小（1平方厘米可种植好几棵）、生长周期快（从发芽到开花不超过6周）、种子多（每株每代可产生数千粒种子）、生命力强（用普通培养基就可作人工培养），其基因组是目前已知植物基因组中最小的；同时，拟南芥属于自花授粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能缺陷型的植株。因此，其被科学家誉为“植物中的果蝇”。

1. CBF基因功能及特性

CBF转录激活因子是一类受低温特异诱导的反式作用因子，它们能与CRT/DRE（C-repeat/dehydration-responsive element）DNA调控元件特异结合，促进启动子中含有这一调控元件的多个冷诱导和脱水诱导基因的表达，从而激活植物体内的多种耐逆机制。拟南芥CBF1转录激活因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达，更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。对冷驯化过程中基因表达差异的认识，使抗冻基因（COR）的克隆及其功能的分析成为研究冷驯化过程的主要目标，在拟南芥和其他抗冻植物中分离出许多COR基因，这些基因对植物抗冻有非常重要的作用。在拟南芥COR调控的研究中发现CBF转录因子的基因家族，其中CBF1能调控一组COR基因的表达。近年来，在冷敏植物如番茄和玉米中发现了CBF类似基因，拟南芥CBF1基因在转基因番茄和小麦中的过量表达提高了植株的抗寒和抗旱性。这一研究结果展示了拟南芥CBF1类似基因的应用可能为冷敏植物抗寒和抗旱性的品种改良提供一条新的途径。

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株、植物材料和载体

拟南芥Columbia（At）、E.coli JM109为本实验室保存，pMD18-T Vector购于TaKaRa公司。

2.1.2主要试剂

树脂型TM PCR产物纯化试剂盒购于赛百盛公司。

Trizol试剂为Invotrigen公司产品，2×Pfu PCR MasterMix购于北京天为时代生物技术公司，DEPC为Sigma公司产品，MLV反转录酶、T4-DNA连接酶为BioLab公司产品，其他常规试剂都购于各生物技术公司。

2.1.3缓冲液配制

焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水：向蒸馏水中加入DEPC至终浓度为0.1%，搅拌至少12h，然后121℃灭菌30 min。

溶液Ⅰ：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml；高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。

溶液Ⅱ：0.1 mol/L NaOH，1%SDS。

溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，过滤灭菌，保存在4℃。

2.2试验方法

2.2.1拟南芥总RNA的提取

用Trizol一步法提取拟南芥叶片的总RNA。为防止RNA的降解，提取RNA所用的器具均用0.1%DEPC室温下浸泡12h以上，然后121℃高温处理。

2.2.1.1取适量拟南芥叶片（经液氮速冻后保存于超低温冰箱）置于研钵内，加液氮，研磨成粉末；

2.2.1.2取加有1ml Trizol试剂的1.5ml离心管，将50mg～100mg研磨好的样品加入离心管，混匀，室温放置5分钟后，4℃，12000rpm/min离心5分钟；

2.2.1.3将上清液转入新离心管中，加200ul氯仿，振荡混匀后，室温放置15分钟，4℃，12000g离心15分钟；

2.2.1.4小心吸取上层水至另一离心管中，加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置5分钟～10分钟。4℃，12000g离心10分钟，弃上清，RNA沉于管底；

2.2.1.5加1ml 75%乙醇，温和振荡离心管。4℃，8000g离心5分钟，尽量弃上清；

2.2.1.6室温晾干或真空干燥5分钟～10分钟，用50μl无RNA酶水溶解RNA样品，通过琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收法确定总RNA的纯度、浓度和完整性，立刻进行下一步的实验或-80℃冰箱保存。

2.2.2反转录

轻轻混合，短暂离心，25℃保温5min，42℃保温60min，95℃处理5min，终止该反应，离心10s～20s，将其放置在37℃下，加入1μL RNAase，轻轻混匀，37℃反应30min，反应结束后，将样品短暂离心，立刻进行下一步的实验或-20℃冰箱保存。

2.2.3引物的设计

根据GenBank数据库查找拟南芥中的一个DREB类转录因子基因CBF1，利用该cDNA基因序列设计引物CBF1up和CBF1down，从拟南芥cDNA中扩增CBF1类转录因子基因。

CBF1up：5'-ATGAACTCATTTTCAGCTTTTTCTG-3'

CBF1down：5'- TTAGTAACTCCAAAGCGACACG -3'

2.2.4PCR片段的扩增

PCR反应体系20 L：2×Pfu PCR MasterMix 10μl，dNTP（10 mmol/L） 1μl，cDNA模板1μl，CBF1up （10μmol/L）和 CBF1down （10μmol/L）各1μl，ddH2O补至 20 L。扩增程序：94℃预变性2min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；然后72℃延伸10min，扩增产物进行电泳检测（1%琼脂糖，80V，20分钟）。

2.2.5 DNA片段的回收

使用树脂型TM PCR产物纯化试剂盒（赛百盛公司） 回收PCR产物，具体操作过程参照使用说明书进行。得到目的片段后，取4μl电泳（0.8%琼脂糖，120V，10分钟）检测并定量测定。

2.2.6PCR片段与T载体的连接

配制A反应混合物（使用前临时配制）：回收PCR片段33μl，10×PCR Buffer 4μl，dNTP（10mmol/L） 2μl，Tag酶1μl，总体积为40μl；把加A反应混合物72℃孵育10 min，加120μl无水乙醇和4μl乙酸钠，混匀后-20℃沉淀20min，13000rpm离心15min。再用70%乙醇洗，13000rpm离心5min。沉淀真空干燥10min后用4.5μL无菌水溶解，用于与pMD18-T载体连接。

按照TaKaRa的pMD18-T Vector说明配制连接反应混合物：DNA片段4.5μl，pMD18-T载体0.5μl，Solution I 5μl，总体积为10μl。把连接反应混合物在16℃保温12-16小时。然后加1μl乙酸钠（1/10体积）和33μL无水乙醇（3倍体积），-20℃沉淀20min，13000rpm离心15min。再用70%乙醇洗，13000rpm离心5min。沉淀真空干燥10min后用5μL无菌水溶解。

2.2.7转化

把Eppendorf管和电转化杯预冷备用，于冰上冻融-70℃保存的感受态细胞，取2.5μL重组载体加入到40μL的感受态细胞中混匀，冰浴1min；将细胞和DNA混合液转到电转化杯中，并将液体敲至杯底。把小杯放入电转仪的小盒中，电击；取出小杯，迅速加入1mL LB培养基，重悬细胞。把细胞转至灭菌的离心管中，37℃轻柔振荡1小时，取电击转化培养液500μL，往离心管中加入40μl X-gal（20 mg/ml）和4μl IPTG（200 mg/ml），混匀后，涂平板，37℃倒置培养过夜。

2.2.8鉴定转化子

从平板上挑取半个白斑菌落，进行PCR鉴定，PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μL，dNTP（10 mmol/L） 1μL，CBF1up （10 μmol/L）和CBF1down（10 μmol/L）各1μl，Taq酶1μl，再挑入半个白斑菌落，用ddH2O补齐到20μL。

扩增程序：94℃预变性2min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，32个循环；然后72℃延伸10min，扩增产物进行电泳检测（1%琼脂糖，80V，20分钟）。

2.2.9质粒DNA的大量提取

2.2.9.1取一管-70℃保存的大肠杆菌（含已转化目的片段的质粒），接种50mL LB培养基（含100μg/mL Amp），37℃ 260r振荡过夜。

2.2.9.2取过夜培养物，5000r，4℃离心3min。

2.2.9.3弃上清，倒置离心管于吸水纸上，吸去残余的液体。

2.2.9.4用3mL溶液I重悬沉淀，在旋涡振荡器上剧烈振荡，使沉淀充分悬浮。

2.2.9.5加入6mL新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀，冰上放置3min。

2.2.9.6加入4.5mL溶液III，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min。

2.2.9.713000r，4℃离心10min，移出上清，用擦镜纸过滤。

2.2.9.8上清中加入0.6-1倍体积的异丙醇，冰上放置10min，13000r，4℃离心10min。

2.2.9.9弃上清，70%乙醇小心漂洗沉淀，稍离心后倾去乙醇，将沉淀于真空干燥器中干燥。

2.2.9.10在干燥后的离心管中，每管加入500mL TE，用枪把沉淀打散，移入Eppendorf管中，加入10μL RNase，37℃保温15min。

2.2.9.11每管加入500μL Tris饱和酚，颠倒混匀，14000r离心3min。

2.2.9.12小心将上层水相移至另一无菌Eppendorf管中，加入500μL 酚∶氯仿，颠倒混匀，14000r离心2min。

2.2.9.13小心将上层水相移至另一无菌Eppendorf管中，加入500μL 氯仿，颠倒混匀，14000r离心15min。

2.2.9.14取上清，加入等体积13.3% PEG8000，冰上放置15min，14000r离心15min。

2.2.9.15弃上清，沉淀用500μL 70%乙醇小心漂洗（尽量不使沉淀漂起来），离心3min。弃去乙醇，沉淀于真空干燥器中干燥。

2.2.9.16用50μL无菌水或TE液溶解沉淀，-20℃保存备用，或酶切电泳检测。

2.2.10双酶切鉴定

重组质粒经EcoR I和 Pst I双酶切处理。酶切体系为：酶切缓冲液2.5μl，PCR产物或载体3.0μl，EcoR I（10U/μl） 1.0μl，Pst I（10U/μl） 1.0μl，无菌水17.5μl，总体积为25μl。37℃孵育1h，琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

3.结果与分析

3.1 RT-PCR扩增CBF1基因

以总RNA为模板，通过MLV反转录酶合成cDNA的一链，再以此为模板，采用CBF1up和CBF1down为引物，扩增激活蛋白cDNA基因，琼脂糖凝胶电泳后，得到一条约1Kb大小的片断，结果如图1。

3.2扩增片段与T载体连接

把片断回收，加A后与pMD18-T载体连接后，重组质粒命名为pT-CBF1，并转化大肠杆菌JM109后，挑取白色菌落，提取质粒，根据T载体上的多克隆位点序列，选用EcoR I和 Pst I进行酶切，琼脂糖电泳，电泳结果如图2：

3.3序列分析

分析序列并利用软件DNAMAN翻译相应蛋白质，得到该基因A、C、G、T数量分别是162、138、186、156，GC%为50.47%。

对翻译所得的蛋白序列进行分析，蛋白长度为213个氨基酸，分子量为23811.4，各氨基酸组成的分析见上表1。

4.总结与讨论

本文根据Tran 等报道的拟南芥中CBF1基因序列设计引物，扩增基因，并连接到克隆载体上，下一步进行原核表达，利用表达产物制备多克隆抗体，用以确定高羊茅、狗牙根、结缕草和马蹄金等抗旱性强的植物中是否含有DREB类转录因子，然后从所筛选的植物中获得新的DREB类转录因子基因，并对该基因进行序列分析、功能预测及其表达研究，同时构建DREB类基因的植物表达载体，为进一步利用DREB类转录因子基因进行其他草坪草的遗传转化，为培育抗旱草坪草品种奠定基础。

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