PEDF对肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力和转移相关蛋白表达水平的影响

程 宇，束 军，徐 胜，李晓峰

PEDF对肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力和转移相关蛋白表达水平的影响

程 宇，束 军，徐 胜，李晓峰

目的观察色素上皮衍生因子（PEDF）对肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力以及对转移相关蛋白如纤维连接蛋白（FN）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达水平的影响。方法设不加PEDF的肺腺癌A549细胞为阴性对照组，PEDF干预组细胞分别加入180、360和720 nmol/L PEDF；Transwell检测PEDF对A549细胞迁移和侵袭能力的影响；半定量RT-PCR法检测PEDF对FN、MMP-9mRNA表达水平的影响；ELISA法检测PEDF对A549细胞培养上清液中和细胞内的FN、MMP-9蛋白表达水平的影响。结果PEDF干预组的A549细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均显著低于阴性对照组（P＜0.05），随着PEDF浓度的增加，迁移和侵袭细胞数逐渐减少（P＜0.05）。各浓度PEDF干预组A549细胞的FN、MMP-9表达水平较阴性对照组显著降低（P＜0.05），随着PEDF浓度的增加，FN、MMP-9表达水平逐渐降低（P＜0.05）。结论PEDF在体外能显著抑制肺腺癌A549细胞的迁移和侵袭能力，能显著抑制转移相关蛋白（FN、MMP-9）的表达水平。

色素上皮衍生因子；肺腺癌；转移；迁移；侵袭

肺癌在恶性肿瘤发病率及死亡率中居于首位。全世界每年新发肺癌病例数为180多万，占所有恶性肿瘤的13%；因肺癌导致的死亡患者近160万，占所有恶性肿瘤死亡的19.4%［1］。转移是肺癌患者预后不良的重要因素，对其转移能力的研究对于肺癌患者的治疗和预后有非常重要的意义。肿瘤的转移是有多步骤的复杂过程，其中肿瘤细胞和细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）之间的相互作用在介导和调节肿瘤的转移中起重要作用［2］。纤维连接蛋白（fibronectin，FN）是细胞外基质的重要组成部分，参与细胞黏附、迁移、侵袭和肿瘤转移。同时，基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）介导的ECM的降解对肿瘤的生长和转移有重要意义［3］。色素上皮衍生因子（pigment epithelial-derived factor，PEDF）在体内生理和病理过程中有多种活性，包括神经营养、抗血管生成、抗肿瘤生成和抗转移等。然而，关于PEDF对肺腺癌转移能力的影响及其机制目前仍不十分清楚。该研究旨在观察不同浓度PEDF对肺腺癌A549细胞迁移和侵袭能力的影响，以及对转移相关蛋白FN和MMP-9表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器人肺腺癌细胞株A549由安徽医科大学基础医学院病原微生物实验室惠赠。人重组PEDF蛋白（美国Peprotech公司）；Matrigel胶（美国B&D公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；逆转录试剂盒（德国Thermo Scientific公司）；ELISA试剂盒（上海源叶公司）；TRIzol（美国Invitrogen公司）；RT-PCR引物（上海Invitrogen公司）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国HyClone公司）；DEPC（美国Sigma公司）；DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；PCR仪（德国Biometra公司）；酶标仪（美国Biotek公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；JD-801凝胶成像分析系统（江苏捷达科技发展有限公司）；超低温冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 细胞培养在37℃、5%CO2细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基常规培养人肺腺癌A549细胞。细胞在培养瓶中贴壁生长，每2～3 d传代1次。

1.3 PEDF干预组与阴性对照组肺腺癌A549细胞的迁移和侵袭能力

1.3.1A549细胞体外迁移实验 取生长状态良好的对数期细胞，PEDF干预组分别加入720、360和180 nmol/L PEDF，阴性对照组不加PEDF，分别作用于A549细胞24 h。常规消化，1 000 r/min离心5 min后，用无血清RPMI-1640培养基调整各组A549细胞密度为2×105/m l，取100μl细胞悬液轻轻加入Trasnwell小室上室，下室中加入10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基600μl，每组3个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。弃上室内培养基，PBS洗两遍，4%多聚甲醛固定30 min，风干后用0.1%结晶紫染色液染色约30 min，医用棉棒轻轻擦去小室膜上表面尚未穿过的细胞。在光学显微镜（×200）下观察拍照，400倍高倍镜下细胞计数，随机选取6个高倍镜视野/孔计数穿过底膜的细胞数，即迁移细胞数，取平均值作为结果。实验重复3次。

1.3.2A549细胞体外侵袭实验 Martigel胶4℃融化后，用4℃预冷的无血清1640培养基按1∶8比例稀释Matrigel。在Transwell上室底部加入50 μl稀释后的Matrigel，铺满小室底，置37℃培养箱干燥30 min，待Martrigel胶凝固后，小心弃去上层析出的液态培养基，每个小室再加入50μl无血清1640培养基，置于37℃30 min水化基底膜。后续步骤同Transwell迁移实验。

1.4 半定量RT-PCR法检测肺癌A549细胞株中FN、MMP-9mRNA

1.4.1RNA提取 取生长状态良好的对数期细胞，PEDF干预组分别加入720、360和180 nmol/L PEDF，阴性对照组不加PEDF，分别作用于A549细胞24 h后重悬细胞，加入TRIzol（1 m l），吹打后分别吸入EP管（无RNA酶）中，加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15 s，冰上静置3 min，低温4℃12 000 r/min离心15 min，取上清液至另一EP管中，加入0.5 ml异丙醇温和混匀，冰上静置10 min，低温4℃12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加1 ml75%乙醇（DEPC处理水配制），低温4℃7 500 r/min离心5 min，弃上清液，室温放置10 min干燥RNA沉淀，加20μl DEPC水于55℃促溶RNA，-80℃保存。

将样品稀释后，利用紫外分光光度计测量各组在260、280 nm波长的吸光度（absorbance，A），计算A260/A280，要求比值在1.8～2.0，表明纯度较高。

1.4.2使用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA

各组分别取总RNA 2μg，按照逆转录试剂盒说明书进行操作，最后合成cDNA产物总体积为20μl，放入-20℃保存。

1.4.3PCR扩增 以合成的cDNA为模板进行扩增。FN的上游引物为：5′-TCGAGGAGGAAATTCCAATG-3′，下游引物为：5′-CTCTTCATGACGCTTGTGGA-3′，产物长度382 bp；MMP-9的上游引物为：5′-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3′，下游引物为：5′-TCAAAGACCGAGTCCAGCTT-3′，产物长度468 bp；GAPDH的上游引物为：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物为：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR仪扩增，程序为95℃5 min，（95℃30 s，55℃40 s，72℃50 s）35个循环，72℃10 min，4℃10 min。

1.4.4琼脂糖凝胶电泳 用0.8%琼脂糖凝胶分离PCR产物，每100 ml琼脂糖凝胶溶液加5μl核酸染料。凝胶成像系统观察结果并进行拍照，分析比较各组FN、MMP-9 mRNA的相对表达量。

1.5 ELISA试剂盒检测细胞培养上清液和细胞内FN、MMP-9蛋白含量取生长状态良好的对数期细胞，PEDF干预组分别加入720、360和180 nmol/L PEDF，阴性对照组不加PEDF，分别作用于A549细胞24 h后收集细胞培养上清液，4℃3 000 r/min离心20 min，小心吸取上清液，分装后于-80℃冻存备用；然后将A549细胞消化离心（1 000 r/min、5 min），重悬后用细胞计数板计数，取含106个细胞的细胞悬液离心，1 m l PBS重悬后，每管细胞加100μl细胞裂解液，用吸管吹打数下，使细胞和裂解液充分接触，室温裂解1 h，再用反复冻融方法裂解细胞，随后4℃12 000 r/min离心30 min，小心吸取上清液，分装后于-80℃冻存备用。依据ELISA试剂盒说明书操作，对细胞培养上清和细胞内FN、MMP-9蛋白含量进行测定。

1.6 统计学处理实验结果采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料用-x±s表示，多组样本均数间的比较采用单因素方差分析，并进行Levene′s方差齐性检验，两两比较采用SNK-q检验。以α =0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 PEDF抑制A549细胞的迁移720、360和180 nmol/L PEDF干预组和阴性对照组的迁移细胞个数分别为（16.44±3.47）、（30.78±2.17）、（42.11±2.36）、（63.67±1.45）个。与阴性对照组相比，各浓度PEDF干预组迁移细胞数均明显减少，且随着PEDF浓度的增加，迁移细胞数逐渐减少，各干预组组间差异有统计学意义（F=138.831，P＜0.05）。见图1。

2.2 PEDF抑制A549细胞的侵袭720、360和180 nmol/L PED干预组和阴性对照组的侵袭细胞个数分别为（11.44±1.58）、（21.67±1.20）、（35.11±2.71）、（44.89±1.07）个。与阴性对照组相比，各浓度PEDF干预组侵袭细胞数均明显减少，且随着PEDF浓度的增加，侵袭细胞数逐渐减少，各干预组组间差异有统计学意义（F=208.998，P＜0.05）。见图2。

2.3 RT-PCR结果720、360和180 nmol/L PEDF干预组和阴性对照组A549细胞中FN mRNA的相对表达量分别是（0.245±0.016）、（0.378± 0.021）、（0.488±0.040）和（0.616±0.026）（图3），MMP-9 mRNA的相对表达量分别是（0.378± 0.020）、（0.521±0.047）、（0.711±0.016）和（0.859±0.021）（图4）。与阴性对照组相比，各浓度PEDF干预组A549细胞的FN、MMP-9 mRNA表达水平均明显降低。随着PEDF干预剂量增加，FN mRNA表达水平逐渐降低，各干预组间组间差异均有统计学意义（F=100.161，P＜0.05）；MMP-9 mRNA表达水平也逐渐降低（F=156.162，P＜0.05）。见图5、6。

2.4 ELISA结果比较不同浓度PEDF处理的A549细胞培养上清液中和细胞内FN、MMP-9蛋白浓度，PEDF干预组比阴性对照组A549细胞上清液中和细胞内的FN、MMP-9表达水平均明显降低。随着PEDF干预剂量增加，细胞上清液中FN的表达水平逐渐降低，不同剂量PEDF干预组间比较差异均有统计学意义（F=446.055，P＜0.05），细胞内FN的表达水平依次递减（F=70.117，P＜0.05），细胞上清液中MMP-9的表达水平（F=1 009.000，P＜0.05）和细胞内MMP-9的表达水平（F= 1 719.000，P＜0.05）也均逐渐降低。见表1、2。

3 讨论

PEDF广泛表达于人体组织，包括脑、眼、脊髓、肝、血浆、骨、心脏和肺。PEDF是Tombran-Tink et al［4］首次在人视网膜色素上皮细胞培养液中发现并提取到的多功能糖蛋白，最初被鉴定为人视网膜色素上皮细胞产生的神经元分化因子。

Chen et al［5］发现在肺腺癌A549细胞和肺鳞癌SKMES1细胞中，人重组PEDF蛋白显著降低肺癌细胞的运动和对细胞外基质的黏附能力；同时在肺癌组织中，PEDF的低表达与淋巴结的转移和肺癌病人的不良预后密切相关。郑民等［6］在对50例非小细胞肺癌组织的研究中发现，PEDF阳性组的微血管密度值和在发生远处转移的患者中所占的比例均低于PEDF阴性组，表明PEDF可能通过抑制微血管的形成从而抑制肺癌的转移，PEDF的检测可能对于判断肺癌是否发生远处转移有一定的意义。研究［7］显示野生型PEDF和三磷酸突变的PEDF都能够通过促进内皮细胞的凋亡和肿瘤内血管的破裂来抑制新生血管生成，阻碍内皮细胞和人脑胶质母细胞瘤细胞本身的迁移。He etal［8］发现在Lewis肺癌鼠模型中，腺相关病毒介导的PEDF基因表达能够在体内抑制其血管生成。马建梅等［9］发现PEDF能有效抑制肺鳞癌细胞SK-MES-1的侵袭能力，对肺鳞癌的转移可能发挥潜在的对抗效应。这些结果表明，PEDF可能有潜在的抑制肺癌及其恶性肿瘤转移的能力。本研究中肺腺癌A549细胞体外迁移实验和侵袭实验结果显示PEDF能有效抑制A549细胞的迁移和侵袭能力。

关于FN和MMPs各自不同功能的研究已有不少，但是关于PEDF与FN、MMPs之间的相互作用仍然知之甚少。关于PEDF与FN相互关系的研究［10］发现，PEDF在体内和体外均能显著抑制乳腺癌的生长和转移；并且，PEDF通过p-ERK和p-AKT信号通路下调纤维连接蛋白和随后的MMP2/MMP9的表达来抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭。在前列腺癌、乳腺癌和骨肉瘤等恶性肿瘤细胞中，已发现PEDF特异性下调膜型基质金属蛋白酶（MT1-MMP）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2），这两种在转移性肿瘤中最常见的基质金属蛋白酶。在对64例膀胱肿瘤组织的关于PEDF与MMP-9相互关系的免疫组化研究［11］中发现，相比于正常尿路上皮，PEDF表达显著下降，而VEGF和MMP-9的表达显著升高。在EL-Kras（G12D）小鼠模型中，PEDF缺乏导致的浸润性胰腺导管腺癌与MMP-2和MMP-9的表达增强有关［12］。PEDF抑制子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭，同时，PEDF下调VEGF和MMP-9的表达，上调血小板反应蛋白的表达［13］。本研究中半定量RT-PCR和ELISA实验结果显示PEDF能显著抑制转移相关蛋白FN和MMP-9的表达水平。

综上所述，PEDF在肺腺癌A549细胞的转移过程中发挥拮抗效应。PEDF可作为内源性抗A549细胞生物活性因子，检测其表达水平可能对判断肺腺癌患者的预后有一定指导意义。但是，本研究只涉及体外细胞层面，PEDF是否能在体内抑制肺腺癌的转移，还有待于下一步动物实验以及临床试验的验证。本研究组前期研究［14-15］表明PEDF可以显著地抑制A549细胞和NCI-H460细胞的增殖、促进细胞形态变化，并诱导其凋亡。因此，PEDF可以发挥限制肺癌生长和转移的双重效应，使其有望成为治疗肺癌的新途径。

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Effects of PEDF on them igration and invasion of lung adenocarcinoma A549 cells and the expression ofmetastatic-related proteins

Cheng Yu，Shu Jun，Xu Sheng，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effects of pigment epithelium-derived factor（PEDF）on the migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell，aswell as the expression ofmetastatic-related proteins including fibronectin（FN）and matrixmetalloproteinase 9（MMP-9）.MethodsA549 cells cultured without PEDF were defined as negative control group，the cells in PEDF intervention group were added 180，360 and 720 nmol/L PEDF，respectively.The effects of PEDF on themigration and invasion of A549 cellwere detected by Transwell assay.The effects of PEDF on the expression of FN and MMP-9 mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR assay，meanwhile the protein of them in supernatant of cell culture and within cellswas detected by ELISA.ResultsThe numbers ofmigrating cells and invasive cells in PEDF intervention group were significantly lower than those in the negative control group（P＜0.05）.With the increase of PEDF concentration，the numbers ofmigrating and invasve cells decreased by degrees（P＜0.05）.The expression of FN and MMP-9 in A549 cellswas significantly lower than that in the control group（P＜0.05）and the expression levelwas remarkably decreased by degreeswith the increase of PEDF concentration（P＜0.05）.ConclusionPEDF can significantly inhibit themigration and invasion of A549 cells in vitro，furthermore，PEDF can significantly inhibit the expression ofmetastasis associated proteins（FN and MMP-9）.

pigment epithelium-derived factor；lung adenocarcinoma；metastasis；migration；invasion

R 734.2；R 73-37

A

1000-1492（2016）03-0345-06

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.016.html

2015-12-08接收

安徽省自然科学基金面上项目（编号：1308085MH141）；

安徽医科大学科研基金资助项目（编号：2010xkj115）

安徽医科大学第四附属医院呼吸内科，合肥 230022

程 宇，女，硕士研究生；

束 军，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：J.Shu @126.com