非酒精性脂肪肝病大鼠IL-1β、IL-18、TNF-α水平的变化

李枫林，张 宝，管石侠，侯丽丽，程 靖，蒋建华

非酒精性脂肪肝病大鼠IL-1β、IL-18、TNF-α水平的变化

李枫林，张 宝，管石侠，侯丽丽，程 靖，蒋建华

目的探讨血清炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠中的变化及意义。方法24只雄性SD大鼠随机分为造模组（n=12）及对照组（n=12），造模组予以高脂饲料喂养，对照组予以普通饲料喂养。分别于实验第4、8周各处死6只大鼠。生物化学法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），ELISA法检测血清IL-1β、IL-18、TNF-α，光镜和电镜下观察肝脏病理变化。结果与同期对照组比较，造模组的大鼠体重、肝湿重及肝指数均增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与同期对照组比较，造模组的ALT、AST、TC、TG高，HDL-C低，差异有统计学意义（P＜0.05）。4周和8周的IL-1β、IL-18、TNF-α水平均较同期的对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。HE染色显示造模组有轻-中度的脂肪变性，电镜下造模组可见大小不等的脂滴。结论喂食高脂饲料8周成功的建立了NAFLD大鼠模型。其中IL-1β、IL-18、TNF-α可作为肝细胞损伤的标志因子，在肝脏脂肪变的发生中起到重要作用。

非酒精性脂肪性肝病；高脂饮食；白细胞介素1β；白细胞介素18；肿瘤坏死因子α

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无过量饮酒史和其他确切的肝损伤因素，并以肝实质细胞脂肪变性和肝脏脂肪贮积为病理特征的临床综合征［1］。其疾病谱是包括非酒精单纯的肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎以及最终演变的肝硬化甚至是肝细胞癌［2］。随着当今生活水平的提高、生活方式的变化和膳食结构的改变，NAFLD的发病率呈逐年上升趋势，并且发生率有显著的年轻化趋势［3］。而Day［4］提出的“二次打击”学说中的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、氧化应激和脂质过氧化仍然是目前NAFLD发病机制中公认的关键因素。尤其提出是细胞内的脂质毒性导致细胞炎性因子释放增多，从而促使肝细胞发生炎症坏死等［5］。该研究旨在探究炎性细胞因子IL-1β、IL-18、TNF-α在大鼠NAFLD发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠24只，购自安徽医科大学动物实验中心，约6周龄，体重140～180 g。

1.1.2主要试剂 ELISA试剂盒购自上海源叶生物技术有限公司；戊二醛溶液购自美国SPI公司。

1.1.3仪器 日立-7600型生化仪（瑞士Roche公司）；μQuant酶标仪（美国Bio-Tek公司）；Universal 320/320 R型低温高速离心机（德国Hettich公司）；LeicaRMZ135型石蜡切片机（德国徕卡公司）；Olympus BX53显微镜（日本Olympus公司）；JEM-1230型透射电镜（日本JEOL公司）；电动恒温箱（上海三发公司）等。

1.2 方法

1.2.1动物分组及造模 实验动物经普通饲料适应性喂养1周后将SD大鼠随机分为对照组12只和造模组12只。对照组喂食普通饲料，造模组喂食高脂饲料，分别于第4、8周末分批处理各组大鼠6只。高脂饲料：88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇；普通饲料及高脂饲料均由安徽医科大学动物实验中心提供并制备。

1.2.2标本采集及处理 大鼠隔夜禁食，次日晨腹腔注射10%水合氯醛，于麻醉后腹主动脉取血，常规制备血清并分装后于-80℃保存备测。迅速取出整块肝脏后称取重量即肝湿重，计算肝指数（%）=肝湿重（g）/体重（g）×100%。

1.2.3血清指标检测 血清生化指标谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）均使用全自动生化分析仪检测；血清炎性细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）均使用ELISA试剂盒测定，步骤严格按照其说明书操作。用酶标仪在450 nm波长下读取各吸光度值，并根据所绘制的标准曲线来计算出相应的浓度值。

1.2.4肝脏病理学观察 于肝右叶同一部位取组织1块，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。在肝左叶同一部位取1块1 mm3肝组织，用4℃2.5%戊二醛溶液固定，环氧树脂包埋，切超薄片，枸橼酸铅染色，电镜下观察肝细胞超微结构变化，是由安徽省立医院病理科专业人士操作。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，计量数据以-x±s表示。两组间计量数据比较采用t检验。

2 结果

2.1 一般情况的比较8周时，对照组的肝脏形态正常，颜色鲜红，质地柔软，表面光滑，边缘锐利；造模组的肝脏体积明显增大，重量也较对照组重，颜色发白，肝脏切面油腻。第4、8周造模组的大鼠体重、肝湿重及肝指数均较同期的对照组显著增高（P＜0.01）。同组间比较，对照组和造模组第8周的体重、肝湿重均较第4周增加明显，且差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 血清生化指标的比较造模组与同期对照组比较，血清ALT、AST、TC、TG水平升高，且第8周时显著升高，差异有统计学意义。造模组HDL-C水平明显低于同期对照组，差异有统计学意义。而同组间比较，对照组和造模组第8组ALT、AST、TC、TG均较第4周升高，HDL-C降低，差异有统计学意义。见表2。

2.3 血清IL-1β、IL-18、TNF-α浓度的比较与同期对照组比较，造模组血清IL-1β、IL-18、TNF-α浓度升高，差异有统计学意义。而同组间比较，对照组和造模组第8周血清IL-1β、IL-18、TNF-α浓度均较第4周升高，差异有统计学意义。见表3。

2.4 肝脏组织病理学结果光镜下HE染色显示，对照组的肝小叶结构清晰完整，肝细胞未见脂肪变性，细胞中央可见细胞核；造模组第4周肝细胞广泛肿胀，肝索排列疏松，肝小叶结构不清，部分动物的肝细胞胞质内可见少数大小不等的脂滴，呈现灶脂变或轻度脂变；造模组第8周全部大鼠肝组织均呈现轻-中度脂肪变性，肝细胞体积明显增大，胞质疏松，内含大小不等的脂滴空泡，尚未见炎性细胞浸润、坏死灶。见图1。透射电镜下可见，对照组肝细胞核周隙正常，线粒体丰富且形态正常，内质网排列整齐，细胞质内未见脂滴；造模组第4周肝细胞内质网排列整齐，线粒体增大但结构尚完整，胞质内可见少量脂滴；造模组第8周细胞体积明显增大，肝细胞内质网形态尚正常，线粒体明显肿胀，少数线粒体嵴消失，胞质内有多数脂滴。见图2。

3 讨论

随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，NAFLD已逐渐发展成为慢性肝病的首位病因，并且其发病率呈逐年上升的趋势，表明NAFLD的防治已经成为当前研究的重要课题。当今人们饮食摄入中的脂肪含量不断增加，而脂肪便是饮食中能量最高的营养物质，能量摄入过多是导致脂肪肝、IR等发生率不断上升的重要因素［6］。脂肪摄入过多可导致三酰甘油在肝细胞内聚集，从而引起脂肪变性。而脂肪过量堆积会引起血清游离脂肪酸增多，对肝细胞和胰岛有“脂毒性”作用，而产生IR［7］。从本研究结果来看，造模组大鼠的体重、肝湿重明显高于同期对照组，造模组ALT、AST、TC、TG较同期对照组明显升高，HDL-C明显降低。肝脏HE染色和电镜结果均表明造模组的肝组织有一定的脂质沉积。表明长期的高脂饮食可诱发肝脏的脂肪变性。而同组间比较，对照组和造模组第8周的大鼠体重、肝湿重及生化指标ALT、AST、TC、TG均较第4周高，HDLC明显降低。并且造模组各项指标升高和降低的幅度明显大于对照组，说明高脂饮食可加快肝脏脂肪变性的速度。

NAFLD的发病机制比较复杂，IR是其中心环节，而细胞因子的异常在其发病过程中起着重要作用。IL-18作为重要的前炎症细胞因子参与炎症反应，在炎症反应过程中起着关键作用。IL-18是T细胞介导肝损伤的必须媒介，IL-18在肝脏中除了由库普弗细胞表达外，还可以由损伤的肝细胞合成［8］。由于IL-18在分泌γ-干扰素的同时也产生了很多的TNF-α、IL-8等炎性细胞因子从而加剧了代谢紊乱及免疫功能损伤，此外，IL-18还促进T淋巴细胞的增殖和分化，而直接介导肝细胞的损伤［9-10］。Vecchie et al［11］发现NAFLD患者与正常人比较，血浆IL-18水平升高，提示IL-18可能是脂肪变性损害和肝脏炎症中的一个重要发病因素。与本研究中造模组IL-18水平较对照组显著升高相符合。肝脏也是TNF-α重要的靶器官，TNF-α是介导肝脏损伤的重要炎症因子，在机体免疫损伤中发挥着细胞毒作用［12］。TNF-α可以刺激脂肪细胞分泌瘦素引起IR，还可以和肝细胞上的TNF-α受体作用而影响肝脏脂肪代谢，抑制胰岛素受体酪氨酸激酶活性，而致IR加重［13］。此外，TNF-α可减弱线粒体的呼吸功能，导致线粒体跨膜电位降低及其内外膜间的通透转换孔道开放，而加强线粒体氧化活性物质和过氧化脂质的形成［10］。库普弗细胞还可产生IL-1β而加剧肝脏炎症及脂肪变性，因IL-1β促进胰岛β细胞的一氧化氮生成和细胞凋亡而导致胰岛β细胞选择性的破坏，从而进一步诱导胰岛素抵抗［14-15］。本研究中，造模组中IL-18、TNF-α、IL-1β的水平都随着高脂饮食引起肝脏病理表现的加重而升高，提示IL-18、TNF-α、IL-1β可作为肝细胞受损的标志因子。

综上所述，高脂饮食喂养大鼠可致肝功能降低、肝脏脂质沉积，说明高脂饮食是NAFLD发展的危险膳食因素。IL-18、TNF-α、IL-1β在NAFLD发病中起着重要的作用，通过血清IL-18、TNF-α、IL-1β浓度的变化，结合肝脏病理变化，可以反映肝脏损伤的严重程度，对判断NAFLD的发展及预后有一定的意义。

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The changes of IL-1β，IL-18 and TNF-αlevels in NAFLD rats

Li Fenglin，Zhang Bao，Guan Shixia，et al
（Dept of Clinical Nutriology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the changes and significance of serum inflammatory factors interleukin-1β（IL-1β），interleukin-18（IL-18）and tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）levels in non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）rats.MethodsTwenty-fourmale SD rats were randomly divided intomodel group and control group. Themodel group（12 rats）were fed with a high-fat diet，and the control group（12 rats）were fed with normal diet. After feeding for 4 and 8 weeks，6 rats were randomly selected to be killed from each group.The serum alanine transaminase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），total cholesterol（TC），triglyceride（TG）and high density lipoprotein cholesterol（HDL-C）weremeasured with biochemicalmethod.ELISA was used to test the levels of IL-1β，IL-18 and TNF-α.The liver pathological changeswere observed under lightmicroscopy and transmission electron microscope.ResultsThe level of weight，liver-wetweight and liver index of ratswere significantly higher in themodel group than the concurrent control group in 4th or 8th week（P＜0.01）.The levels of ALT，AST，TC，TG were significantly higher and HDL-Cwas significantly lower in themodel group than the concurrent control group in 4 or 8 week（P＜0.05）.The level of IL-1β，IL-18 and TNF-αwere significantly higher in the model group than the concurrent control group in 4th or 8th week（P＜0.05）.HE staining showed mild-to-moderate hepatic steatosis in themodel group.Under transmission electron microscope showed lipid droplets in different number.ConclusionThe NAFLD ratsmodel is established successfully by feeding high-fat diet for 8 weeks.IL-1β，IL-18 and TNF-αare symbolic inflammatory factors of hepatocyte damage，andmay play important roles in the progress of hepatic steatosis.

non-alcoholic fatty liver disease；high-fat diet；interleukin-1β；interleukin-18；tumor necrosis factoralpha

R 589.2

A

1000-1492（2016）03-0351-04

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.018.html

2015-12-08接收

安徽省年度科研项目（编号：1301043019）

安徽医科大学第一附属医院临床营养科，合肥 230022

李枫林，女，硕士研究生；

蒋建华，女，主任医师，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：Jjhua@yeah.net