抑郁大鼠海马区微管蛋白表达的变化

袁 杨，刘 昊，王海涛，徐爱军

抑郁大鼠海马区微管蛋白表达的变化

袁 杨1，刘 昊1，王海涛2，徐爱军2

目的探索抑郁症大鼠海马区磷酸化微管相关蛋白-2（pMAP-2）表达和与之对应组织形态学上的变化。方法将成年大鼠随机分为对照组、模型组，采用慢性不可预见性温和应激方法建立抑郁大鼠模型，采用糖水偏好实验、旷场实验以及Morris水迷宫对其进行行为学检测，尼氏染色法观察海马神经元形态学改变，Western blot检测1、7、14、28 d对照组、模型组海马组织中pMAP-2蛋白表达水平。结果与对照组相比，糖水偏好实验模型组糖水消耗量和糖水偏好百分比分别降低（P＜0.05），模型组在旷场实验、中央活动时间、行走总里程、以及直立次数和修饰行为等均降低（P＜0.05），Morris水迷宫模型组相对于对照组平均逃避潜伏期增高（P＜0.05），相比于对照组，CUMS后1 d模型组大鼠海马p-MAP2蛋白表达较少（P＜0.05），但是从第7天开始持续的高表达（P＜0.05），在14 d时这种高表达到了最高峰（P＜0.05），并且这种增高在第28 d时依然非常明显（P＜0.05）。与对照组比较，模型组海马神经元体积萎缩，数量减少。结论pMAP-2在抑郁模型大鼠海马出现先降低后增高的现象，可能与海马体积异常变化有关。

抑郁症；海马；微管相关蛋白；大鼠

抑郁症是一种慢性、反复发作的情感性精神疾病，发病率高，危害大，但其具体发病机制未明。影像学研究［1-2］显示，抑郁症患者和动物模型大脑海马区容积明显减少，其原因可能与海马神经元凋亡异常增强有关［3］。抑郁症大鼠海马神经元出现突起减少、体积萎缩和排列疏松等现象［2］。研究［4］表明，抑郁症患者海马区神经元细胞存在可塑性变化。因此，推测抑郁症海马区神经元存在细胞骨架改变。微管是细胞骨架的重要成分，其稳定性受微管相关蛋白（microtubule-associated protein，MAPs）的调控［5］。微管相关蛋白2（MAP-2）是研究最多的微管相关蛋白，但其在抑郁症中的变化目前研究不多。为明确抑郁症发病过程中MAP-2的改变，该实验建立大鼠抑郁症模型，检测MAP-2及其磷酸化的改变。

1 材料与方法

1.1 材料健康成年SD大鼠60只，（170±20）g，由华北理工大学实验动物中心（SCXK京2009-0004）提供，适应性饲养1周，饲养条件：23～26℃、昼夜节律（12/12）、自由摄食饮水。pMAP-2兔多克隆抗体（英国Abcam公司）；β-actin小鼠单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.2 分组及动物模型建立将60只SD大鼠分为对照组和模型组，每组各30只。模型组大鼠给予慢性不可预见性温和应激（CUMS）建立抑郁症模型。应激包括：禁锢24 h，鼠笼45℃倾斜摇晃15 min，潮湿垫料24 h，冰水游泳（4℃，5 min），热水游泳（42℃，5 min），禁食禁水24 h，双耳电击（每次10 s，间隔50 s总共两次，0.8 mA），夹尾（位置距尾根1 cm，1 min），明暗交替改变昼夜习性（1 h照明，1 h黑暗，交替持续24 h）。以上应激刺激在22 d内随机进行，每日1次，同种应激不连续出现。对照组大鼠除不做特殊处理。于应激实验后1、7、14、28 d分别处死大鼠用于实验。

1.3 行为学评估每组取15只大鼠进行行为学测试，包括：①糖水偏好实验测定前禁水禁食24 h，实验与对照组每笼都放置1%蔗糖水和纯净水各一瓶，测量1 h内两瓶水的消耗量，糖水偏好率（%）=糖水消耗量/总液体消耗量×100%，计算糖水偏好率；②旷场实验将大鼠放置旷场中心方格内，通过行为学实验分析系统计算5 min内大鼠行为学，测试内容包括穿越总路程、中央活动时间、站立次数、修饰行为；③Morris水迷宫实验观察3 d时程，记录大鼠逃避潜伏期。

1.4 Westernblot法检测pMAP-2蛋白表达取新鲜大鼠脑组织分离海马，用RIPA裂解液提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经10%SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，BSA封闭，pMAP-2兔多克隆抗体（1∶1 000）一抗，4℃孵育过夜，羊抗兔IgG（1∶5 000）二抗室温孵育2 h，ECL显色。内参照β-actin经历相同的实验过程。选取目的条带光密度比值与内参相应光密度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.5 统计学处理使用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，数据用-x±s表示，行为学检测进行独立样本t检验，多时间点pMAP-2蛋白检测选取单因素方差分析和LSD检验。

2 结果

2.1 糖水偏好实验对照组大鼠的糖水消耗量与糖水偏好率分别为（42.42±9.31）ml、（71.62± 6.73）%。模型组大鼠的糖水消耗量与糖水偏好率分别为（28.60±4.61）ml、（60.01±2.12）%。与对照组相比，模型组的糖水消耗量与糖水偏好率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 旷场及Morris水迷宫实验旷场实验模型组行走总路、中央活动时间、直立次数和修饰行为分别低于对照组（P＜0.05），Morris水迷宫模型组平均逃避潜伏期高于对照组（P＜0.05）。见表1、图1。

2.3 尼氏染色对照组大鼠海马神经元形态规则，排列整齐，胞浆中能够观察到丰富致密的尼氏体。模型组海马神经元数目减少，排列稀疏，有较多的核固缩、胞浆中尼氏体数目明显减少。见图2。

2.4 各组大鼠海马pMAP-2蛋白表达水平根据条带分析显示与对照组比较，pMAP-2蛋白在CUMS后1 d蛋白表达低于对照组（P＜0.01），7 d后开始升高（P＜0.01），14 d明显高于对照组（P＜0.01），28 d仍略高于对照组（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

抑郁症主要的临床特征为显著而持久的心境低落，并伴随着思维迟缓、意志活动力减弱、认知及躯体运动功能减退等临床表现，严重时可能会伴有自杀倾向，严重威胁人们的身心健康。抑郁症动物模型的建立促进了抑郁症的基础研究，本实验采用CUMS应激方法建立抑郁症大鼠模型，行为学结果显示，接受CUMUS应激后模型组大鼠的糖水消耗量和糖水偏好百分比明显降低，自主与探究行为明显减少、空间记忆学习能力减退，提示CUMS大鼠能够很好模拟抑郁症主要特征。

抑郁症动物模型［2］，或是抑郁症患者［6-7］，海马结构都会出现异常变化，即双侧海马体积萎缩。为探讨抑郁症大鼠海马神容积缩小的原因，利用尼氏染色观察海马神经元的改变。结果表明，CUMS应激后海马神经元细胞密度小，排列疏松，细胞核萎缩，突起减少；这可能是抑郁症患者海马容积缩小的原因之一。研究［8-9］表明，抑郁症患者在其经受应激的过程中海马区存在神经可塑性变化。细胞骨架是维持神经细胞形态结构的重要基础，当受到应激等相关刺激发生神经可塑性改变时，细胞骨架随之发生改变。微管是细胞骨架的物质组成，对细胞起支撑作用。微管的聚合、解聚这一过程MAPs调控。研究［9］显示MAP-2能够参与神经突起生长和突触可塑性过程。MAP-2磷酸化后能参与调节微管的结合和解离过程，从而影响微管的稳定［10-11］。本研究检测了抑郁症pMAP-2的改变，结果表明CMUS应激后大鼠海马组织中pMAP-2在应激初期显著降低，而后7 d后开始升高，14 d达到高峰，28 d回落但依旧高于对照组。因此推测在应激抑郁症发病过程中，pMAP-2的变化可能影响微管的稳定性，这可能海马体积改变的原因之一，其在抑郁症发病中的关系有待于进一步深入的研究。

［1］ 谭川雪，王飞飞，陈林木，等.抑郁症大鼠海马CA1区及齿状回毛细血管的体视学研究［J］.重庆医科大学学报，2015，25（5）：6-7.

［2］ 徐爱军，刘 昊，刘 英，等.抑郁症大鼠海马体积异常的形态学探讨［J］.中风与神经疾病杂志，2014，31（2）：118-20.

［3］ 窦立敏，吴鹤鸣，王 东.慢性应激抑郁模型大鼠海马凋亡率的不对称性改变［J］.江苏医药，2015，41（4）：380-2.

［4］ 许委娟，许 毅.抑郁症与神经可塑性［J］.国际精神病学杂志，2011，38（3）：184-7.

［5］ 林抒豪，石玉秀，韩 芳.细胞凋亡与真核细胞骨架蛋白相关性的研究进展［J］.解剖科学进展，2015，10（2）：207-10.

［6］ Boldrini M，Santiago A N，Hen R，et al.Hippocampal granule neuron number anddentate gyrus volume in antidepressant-treated and untreated major depression［J］.Neuropsychopharmacology，2013，38（6）：1068-77.

［7］ Zannas A S，McQuoid D R，Payne M E，et al.Negative life stress and longitudinal hippocampal volu-me changes in older adultswith and without depression［J］.JPsychiatr Res，2013，47（6）：829-34.

［8］ McEwen B S，Gianaros P J.Stress-and allostasis-induced brain plasticity［J］.Annu Rev Med，2011，62：431-45.

［9］ Tang L，Lu Y，ZhengW，etal.Overexpression of MAP-2 via formation of microtubules plays an important role in the sprouting of mossy fibers in epileptic rats［J］.JMol Neurosci，2014，53（1）：103-8.

［10］Wang Y，Wang Y，Dong J，et al.Developmental hypothyroxinaemia and hypothyroidism limit dendritic growth of cerebellar Purkinje cells in ratoffspring：involvementofmicrotubule-associated protein 2（MAP2）and stathmin［J］.Neuropathol Appl Neurobiol，2014，40（4）：398-415.

［11］Pereno G L，Beltramino C A.Timed changes of synaptic zinc，synaptophysin and MAP2 in medial e-xtended amygdala of epileptic animals are suggestive of reactive neuroplasticity［J］.Brain Res，2010，1328（1）：130-8.

Changes of the expression ofm icrotubule-associated protein in the hippocampus of depressed rats

Yuan Yang1，Liu Hao1，Wang Haitao2，et al
（1Dept of Neurology，Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan 063000；2Dept of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000）

ObjectiveTo explore themicrotubule-associated protein 2（pMAP-2）expression in hippocampal of the depression rats and the corresponding changes of histomorphology.MethodsThe SD rats were randomly divided into contol group and model group，the depression ratmodelwas produced by giving the chronic unpredictablemild stess（CUMS）.The depressional behabior was examined by useing surose preference test，tail-suspension test and Morriswatermaze.Themorphological change of hippocampal neurons was carried out by Nissl staining.At 1，7，14，28d aftermodeling，the expression of pMAP-2 in hippocampal of control group and model group were detected by the Western Blot.ResultsCompared to control group，the consumption of sucrose and percentage of sucrose preference of rats inmodel group were significantly lower，while in open field test，the totalwalking distance，central activity time，up-right times and grooming behavior in model group were also lower than that in control group（P＜

0.05）.In the Morriswatermaze，themodel group average escape latency period is higher than that in control group（P＜0.05）.Compared with the Sham group，the expression of p-MAP2 in model group was obviously lighter in 1 d after CUMS（P＜0.05），but continuous high expression from 7 d（P＜0.05），reached its highest point in 14 d（P＜0.05），and the high expression in 28 d is still very obvious（P＜0.05）.Compared to control group，the neuroanl body was smaller，and the number of neurons was decreased.ConclusionThe expression level of pMAP-2 protein in the depressionmodel of hippocampus of rats decreases firstly and then increases，which is probably related to the change in the hippocampal volume abnormal of depression.

depression；hippocampus；microtubule-associated protein；rats

R 749

A

1000-1492（2016）03-0355-04

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.020.html

2015-12-08接收

国家自然科学基金项目（编号：81201048）

1华北理工大学附属医院神经内科，唐山 063000

2华北理工大学基础医学院组织胚胎学系，唐山 063000

袁 杨，女，硕士研究生；

刘 昊，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：liuhao938@163.com