CD11c和MHC-Ⅱ在肝细胞癌中的表达及其与肿瘤血管生成的相关性

张楠楠，石 海，许建明，胡乃中

◇临床医学研究◇

CD11c和MHC-Ⅱ在肝细胞癌中的表达及其与肿瘤血管生成的相关性

张楠楠，石 海，许建明，胡乃中

目的探讨树突状细胞（DCs）的数量及成熟情况在肝细胞性肝癌（简称肝癌）中的表达及其与肝癌微血管密度（MVD）的相关性。方法收集50例肝癌患者术后癌组织及癌旁组织标本，并通过免疫组化方法检测石蜡切片中DCs特异性标志CD11c、MVD标志CD34以及DCs成熟标志的主要组织相容性复合物Ⅱ类分子（MHC-Ⅱ）的表达情况并进行相关分析。结果癌组织中CD11c和MVD明显高于癌旁组织（P＜0.01）；癌组织中MHC-Ⅱ明显低于癌旁组织（P＜0.01）。MVD与MHC-Ⅱ呈负相关性（r=-0.480，P＜0.01），而与CD11c则无明显相关性。癌组织中各项指标的表达与肝癌的转移、TNM分期存在相关性（P＜0.05）。结论肝癌组织中CD11c、MHC-Ⅱ的表达与肝癌的转移及TNM分期密切相关；MVD的高表达与浸润性DCs的成熟度呈负相关性，提示增加DCs的成熟度可能成为肝癌抗血管治疗的潜在靶点之一。

肝细胞癌；树突状细胞；肿瘤微血管；主要组织相容性复合物Ⅱ类分子；免疫组化

肝细胞癌（简称肝癌）是我国常见的恶性肿瘤之一，其临床病死率高，治疗效果差，易复发与转移是影响肝癌患者预后的首要因素［1］。因肝癌是典型的多血管肿瘤，在其生长与转移中离不开肿瘤血管提供的营养物质及氧气。肝癌组织中微血管密度（microvascular density，MVD）直接反映了血管生成情况。树突状细胞（dendritic cells，DCs）作为机体最强的一类抗原提呈细胞，广泛的分布于皮肤、黏膜、呼吸道、消化道等机体组织中，其最大特点是能有效地刺激静息型T淋巴细胞、诱发初次免疫应答的独特功能，在机体抗肿瘤免疫中处于中心地位。DCs分为成熟DC（mature dendritic cell，mDC）和未成DC（immature dendritic cell，imDC）［2］。imDC能诱导免疫耐受，mDC可启动免疫应答。该研究主要对DCs浸润数量、成熟情况与肝癌微血管密度的关系进行探讨。为肝癌的进一步研究及治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集安徽医科大学第一附属医院肝胆外科2009年7月～2012年1月行外科手术治疗并经病理证实的50例肝癌患者的癌组织及癌旁组织。上述患者术前均未接受抗肿瘤治疗。其中男41例，女9例；年龄30～79（58.41±10.13）岁。包膜完整者32例，不完整者18例；乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）阴性者12例，阳性者38例；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）：≤20 ng/ml者20例，＞20 ng/ml者30例；肝癌组织Edmondson分级：I～Ⅱ级29例，Ⅲ～Ⅳ级21例；肿瘤转移者25例，无肿瘤转移者25例；按照2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（UICC/ AJCC）第七次修定的HCC TNM临床分期标准［3］：I～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期20例。以上材料得到患者及其患者家属的书面同意和安徽医科大学医学伦理委员会的批准。

1.2 主要试剂兔抗人单克隆抗体CD11c、主要组织相容性复合物Ⅱ类分子（major histocompatibility complex classⅡ，MHC-Ⅱ）（美国Abcam公司），鼠抗人单克隆抗体CD34mAb工作液、DAB、PBS、免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1免疫组化染色 由CD11c和MHC-Ⅱ分别代表DCs与mDC的含量。常规石蜡包埋组织切片，制成厚3～4μm的连续切片，经脱蜡、水化，按要求进行抗原修复后，运用抗生素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）进行酶组织化学染色（一抗：兔抗人单克隆抗体CD11c，按1∶150稀释；兔抗人单克隆抗体MHC-Ⅱ，按按1∶800稀释），DAB显色，苏木精复染，0.1%盐酸酒精分化。切片经梯度酒精脱水干燥后用中性树脂封片。采用PBS代替第一抗体作为阴形对照。结果判断：采用双盲法请两位病理专家对染色结果进行评估。CD11c定位于细胞膜上，以细胞膜染色见棕褐色颗粒者为阳性细胞；MHC-Ⅱ定位于细胞膜或细胞质上，出现棕褐色染色的细胞为MHC-Ⅱ阳性细胞；先在低倍镜（×100）视野下观看切片，随机在癌组织和癌旁中选取5个具有代表性不重叠的区域，然后在高倍镜（×200）下进行计数，取这5个视野均值进行统计，对染色阳性细胞计数。

1.3.2微血管染色与计数标准 通过免疫组化染色方法计数50例患者肝癌组织内的微血管。根据SP法，使用鼠抗人CD34抗体进行免疫组化染色，光学显微镜下观看到染色的区域即为肿瘤血管形成。MVD计数标准按照Weidner［4］方法：对任何被染成棕褐色或棕黄的、分界清晰的内皮或者内皮细胞团簇视为一个血管计数，但是对于内皮细胞个数大于8个时应排除在外。先在低倍镜（×100）下观看整个切片，寻找到3个高血管密度区（即热区），然后在高倍镜（×200）下计数微血管数量。记录这3个视野的微血管数量，取其平均值作为肝癌组织的MVD值。

1.4 统计学处理使用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以表示，采用t检验进行检验分析；相关分析使用Pearson相关分析；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色CD11c、MHC-Ⅱ、CD34在肝癌及癌旁组织中的表达免疫组织化学染色结果显示CD11c定位于细胞膜上，MHC-Ⅱ定位于细胞膜或细胞质上，两者染色均为棕褐色。CD34标记的MVD染色呈棕褐色或棕黄色。癌组织中CD11c和MVD表达为（31.10±5.39）、（47.40±15.85）个，明显高于癌旁组织（25.68±4.60）、（16.28±7.37）个（P＜0.01）；癌组织中MHC-Ⅱ的表达为（13.34± 3.99）个，明显低于癌旁组织（18.92±5.09）个（P＜0.01），见图1、2。

2.2 肝癌组织中MVD与CD11c、MHC-Ⅱ表达的相关分析经Pearson相关分析检验，肝癌组织中MVD与MHC-Ⅱ表达呈负相关（r=-0.480，P＜0.01），见图3。MVD与CD11c无明显相关性（r= 0.247），见图4。

2.3 CD11c、MVD、MHC-Ⅱ在肝癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系肝癌组织中CD11c、MHC-Ⅱ的表达与肝癌有无转移、TNM分期有关（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤包膜是否完整、肝硬化、Edmondson分级、AFP水平以及HBsAg等临床病理特征无关；但MVD的表达与肝癌有无转移、TNM分期、肝硬化、Edmondson分级、AFP水平等临床病理特征有关（P＜0.05），见表1。

3 讨论

DCs作为体内最重要的抗原提呈细胞，最大特点是唯一能够激活静息型T细胞的抗原提呈细胞。DCs在抗肿瘤免疫过程中发挥着强大的免疫监视功能。通过对大量实体肿瘤的研究［5-6］也表明患者的预后与DCs的浸润程度有关，肿瘤内浸润的DCs的数量越多则患者的预后越好。在大多数组织中，DCs以未成熟的形式出现，主要作用是捕获抗原及加工处理。一旦imDC发现损伤或者病原体相关分子存在时，便开始进入成熟状态［7］。当DCs进入成熟状态后，其就会丧失捕获抗原的能力，转化为抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC），并在召集初始T细胞、诱导肿瘤特异性免疫应答上发挥主要作用。随着DCs的成熟，其表面分子标志也随之发生变化，mDC表面主要表达大量的MHC-Ⅱ、共刺激分子B7、黏附分子（ICAM-1）以及各种刺激T淋巴细胞相关反应的共刺激分子；而imDC低表达这些分子，并可以介导免疫耐受［8-9］。CD11c是目前最常用的DCs标志物之一，mDC和imDC均可以表达该分子［10］。迅速生长的肿瘤通过召集DCs并促使IL-6、IL-10、转化因子、血管内皮生长因子、类前列腺素等释放阻止DCs的分化、成熟及其体内外其他的功能［11］。本研究使用CD11c和MHC-Ⅱ来检测肝癌组织及癌旁组织中DCs与mDC的含量，结果提示肝癌组织中CD11c的阳性个数显著高于癌旁组织，而MHC-Ⅱ的阳性个数明显低于癌旁组织。提示癌组织中DCs的含量高于癌旁组织，而有抗原提呈能力的mDC含量相对于癌旁组织减少，推测导致肿瘤细胞免疫逃逸，促使肿瘤细胞进一步生长、增殖的原因之一。

肿瘤细胞的增殖、浸润、转移等生物学行为离不开丰富的血管网提供的营养成分和氧气。作为多血管肿瘤，肝癌有生长快、易转移等特点。寻其原因，肿瘤微血管生成在其上述恶性生物学行为中发挥着不可或缺的作用［12］。因此，抗肿瘤血管生成已成为有效的抗肿瘤方法之一。由于血管生成是肿瘤微环境中产生的多种促血管因子和抑血管因子双重调控的结果。MVD可以直接反映血管生成情况，CD34抗体是区分肝癌与良性肿瘤的最好指标［13］。为了进一步了解MVD与CD11c、MHC-Ⅱ的关系，本研究用了特异性最高的血管内皮细胞标志物CD34进行研究，显示肝癌癌组织中的MVD值明显高表达于癌旁组织，说明癌组织中新生血管的活力要明显高于癌旁组织，有利于肿瘤细胞的生长；癌组织中MVD与CD11c无明显相关性，与MHC-Ⅱ成呈负相关关系。即表明MVD与组织中浸润mDC数量成负性相关关系，与总DCs的含量无关。说明肿瘤血管的生成受DCs成熟情况的影响。这是因为imDC能够以一种特殊的形式进入血管壁并定植于血管周围，支持血管的构成［14］；而且还能通过产生一些旁分泌信号（如IL-8，血管内皮生长因子）有利于血管的生成、构造及成形，并分化诱导血管内细胞的定植，促使肿瘤血管的生长、发展及成熟。

综上所述，本实验显示肝癌组织中DCs、MVD的含量明显高于癌旁组织，而mDC的含量低于癌旁组织，MVD与mDC之间存在负相关性；并且肿瘤有无转移及TNM分期也影响这些指标的表达。即表明肿瘤的微环境（肿瘤内血管形成和局部免疫反应）影响肝癌患者的预后。目前相关研究［15］证实阻止新生血管的生成后，实体肿瘤组织中细胞生长和死亡达到相对平衡，肿瘤便进入静止状态，不会生长成为临床上可见的肿瘤。因此，遏制肿瘤新生血管的生成也就阻止了肿瘤的生长，但是由于细胞因子之间以及细胞免疫系统与肿瘤之间存在着复杂的关系，对某些因素进行单独处理，往往不能取得满意的结果。本研究提示在采用现阶段肝癌治疗手段的同时结合有选择性的应用DCs进行免疫治疗、抗血管生成治疗，可阻止肝癌的生长、增殖。因此，对肿瘤组织浸润DCs成熟度的干预可能成为肝癌抗血管治疗的潜在靶点之一。

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Expression of CD11c and MHC-Ⅱin hepatocellular carcinoma and any association w ith tumor angiogenesis

Zhang Nannan，Shi Hai，Xu Jianming，et al
（Deptof Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore the expression of the number and maturation of DCs inhepatocellular carcinoma（HCC）tissues and any association with tumormicrovascular density（MVD）.MethodsFifty cases of HCC tumor andparacarcinomatous tissueswere collected.Immunohistochemistry methods was used to detect the expressions of CD11c，CD34，and major histocompatibility complex classⅡ（MHC-Ⅱ）to analyze the correlation among them.ResultsCD11c，MVD in HCC tissueswas higher than that in the surrounding tissues.The MHC-ⅡinHCC tissueswas significantly lower than that in the surrounding tissues.There was a negative correlation between the MVD value and the expression of MHC-Ⅱ（r=-0.480，P＜0.01）；there was no correlation between the MVD and the expression of CD11c.The expressions of CD11c and MHC-Ⅱin HCC tissues were related to HCC metastasis and TNM classification（P＜0.05）.ConclusionIn HCC tissues，The expressions of CD11c and MHC-Ⅱwere related to HCCmetastasisand TNM classification；The higher expressions of MVD was a negative correlation with MHC-Ⅱ，which indicate that the increase ofmaturation of DCsmaybe come one of the potential targets anti-angiogenesis therapy of HCC.

hepatocellular carcinoma cell；dendritic cells；major histocompatibility complex classⅡ；tumor microvessel density；immunohistocemistry

R 735.7

A

1000-1492（2016）03-0388-05

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.034.html

2015-12-08接收

安徽省自然科学基金资助项目（编号：1308085MH147）

安徽医科大学第一附属医院消化内科，合肥 230022

张楠楠，女，硕士研究生；

石 海，男，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：shmdah@163.com