糖原合成激酶-3对肝硬化失代偿患者脂多糖介导的过度炎症反应的影响

范声春，徐 龙，罗盼

糖原合成激酶-3对肝硬化失代偿患者脂多糖介导的过度炎症反应的影响

范声春，徐 龙，罗盼

目的探讨糖原合成激酶-3（GSK-3）在脂多糖（LPS）诱导肝硬化患者外周血单核细胞（PBMCs）炎症反应中的作用。方法将不同分期的肝硬化患者PBMCs分为对照组、LPS组、SB216763组、SB216763+LPS组，收集细胞培养上清液，采用ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）与白细胞介素10（IL-10）的表达水平。结果所有研究对象中，LPS组TNF-α和IL-10含量明显高于对照组（P＜0.01），SB216763+LPS组TNF-α和IL-10的含量较LPS组明显降低（P＜0.01）。肝硬化失代偿期并腹膜炎患者、LPS组的TNF-α含量显著高于肝硬化代偿期患者（P＜0.05），而IL-10的表达水平与代偿期患者比较无明显改变。在SB216763+ LPS组、肝硬化失代偿期并腹膜炎患者TNF-α和IL-10的含量与肝硬化代偿期患者无明显差异。另外，TNF-α的表达水平随Child-Pugh分级和MELD评分增加逐渐升高，而IL-10的表达水平却无明显变化。结论抑制GSK-3的活性可以减少TNF-α和IL-10的分泌，为肝硬化失代偿期合并腹膜炎患者的治疗提供了一个新思路。

糖原合成酶激酶-3；脂多糖；失代偿期肝硬化

肝硬化失代偿患者内毒素血症发生率可达到46.5%～75.9%［1］，细菌产物如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露在血液循环的早期，体内免疫细胞促炎因子分泌增多和抗炎因子分泌减少［2］。LPS通过激活单核/巨噬细胞与TLR4受体结合再激活核转录因子кB（nuclear transcription factors，NF-кB），NF-кB进而诱导多种炎症因子的表达介导炎症反应。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是广泛存在于真核生物体内的丝/苏氨酸激酶家族，参与细胞的生长、活化和凋亡。最近研究［3］显示，GSK-3参与人类的炎性疾病，主导炎性因子的产生，对NF-кB的活性调节起到很重要的作用，在调节炎症细胞因子和抗炎症细胞因子之间的平衡中起关键作用。该研究旨在探讨GSK-3活性在维持LPS诱导乙肝肝硬化失代偿患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分泌促炎因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）和抗炎因子白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）平衡调节中的作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料研究对象为南昌市第九医院住院患者，肝硬化失代偿期患者合并腹膜炎30例、肝硬化失代偿期30例、肝硬化代偿期患者15例，临床资料见表1。乙型肝炎后肝硬化诊断参考《慢性乙肝防治指南（2010版）》，排外心、肺、脑、肾等器官实质性病变；腹膜炎诊断标准：①不同程度的发热、寒战、腹痛、腹部压痛及反弹痛；②腹水中性多形核细胞数＞0.25×109/L；③腹水培养阳性/阴性；④腹水迅速增加、利尿效果不佳［4］。CTP评分依据Child-Turcotte-pugh分级，A级5～6分，B级7～9分，C级＞9分，MELD评分即终末期肝病评分，MELD=9.6×In［肌酐（mg/dl）］+3.8×In［胆红素（mg/dl）］+11.2×In（INR）+6.4×病因：胆汁淤积性和酒精性肝硬化为0，其他病因为1。

1.2 试剂胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；人TNF-α、人IL-10 ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；GSK3抑制剂SB216763购自美国Selleck公司；LPS购自美国Sigma公司。

1.3 方法用无菌无热原抗凝试管采集研究对象新鲜外周静脉血2 ml，立即在实验室超净台内采用淋巴细胞分离液（Ficoll分层液、密度1.077±0.01）运用密度梯度离心法（1 500 r/min，30 min）分离提取出PBMCs，对每一份标本新鲜分离出来PBMCs用PBS洗涤2次后，立即进行细胞计数及台盼蓝染色法计算细胞活力，对细胞计数及活力符合要求的样本PBMCs移入2 ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，细胞密度调整为5×105/ml。将2 ml含PBMCs的细胞混悬液均分成为对照组、LPS组（单予LPS刺激）、SB216763（GSK3抑制剂）组（单予SB216763处理）、SB216763+LPS组（先予SB216763处理后予LPS刺激），每组细胞悬液0.5 ml，分别将4组细胞悬液移入24孔板内。对照组孔内不加任何刺激物；LPS组加入终浓度为1μg/ml的LPS；SB216763组加入终浓度为10μmol/L SB216763；SB216763+LPS组加入终浓度为10 umol/l SB216763预先处理1 h后再加入终浓度为1 μg/ml的LPS刺激20 h。各组组刺激结束后收集细胞悬液移入离心管低速离心（1 000 r/min，10 min）后吸取上清液分装入EP管内，放置-20℃冰箱备检。细胞因子TNF-α、IL-10的定量测定采用ELISA试剂盒（双抗体夹心法）。取出细胞培养上清液、TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒放置室温平衡，然后按操作步骤酶标仪测定细胞因子水平。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0统计分析软件，数据以-x±s表示，多组间均数的比较采用方差分析，两组间的比较采用LSD法（多组间方差齐）和Dunnett T3法（多组间方差不齐）进行。

2 结果

2.1 研究对象PBMCs分泌TNF-α的比较与肝硬化代偿期患者比较，肝硬化失代偿期患者无明显变化，而失代偿肝硬化并腹膜炎患者LPS组TNF-α分泌量明显增加，LPS刺激组F=15.93，SB216763 +LPS组F=6.15，（P＜0.01），提示失代偿肝硬化并腹膜炎患者促炎因子TNF-α随着病情加重分泌持续增加。LPS组TNF-α含量明显高于对照组和SB216763组（P＜0.01）；与LPS组比较，SB216763 +LPS组TNF-α含量明显下降（P＜0.01）。提示抑制GSK的活性可以明显减少TNF-α的分泌。见表2。

2.2 研究对象PBMCs分泌IL-10的比较各研究对象PBMCs，与肝硬化代偿期患者比较，肝硬化失代偿期和肝硬化失代偿期并腹膜炎患者LPS组IL-10含量无明显差异，提示失代偿期抗炎因子IL-10无明显升高。与对照组比较，LPS组IL-10含量明显升高，LPS刺激组F=10.22（P＜0.01）；与LPS组比较，SB216763+LPS组IL-10含量明显下降，SB216763+LPS组F=6.04（P＜0.01），提示抑制GSK的活性可以明显减少IL-10的分泌。见表3。

2.3 肝硬化失代偿患者中Child-Pugh分级对TNF-α、IL-10分泌的影响在肝硬化失代偿患者中Child-Pugh分级A、B、C级TNF-α的表达水平差异有统计学意义（F=4.75，P=0.017）。与A级比较，B级C级TNF-α的表达水平显著升高（t=2.32、3.14、P＜0.01）。在肝硬化患者中Child-Pugh分级A、B、C级IL-10的表达水平差异有统计学意义（F =5.46，P=0.01）。与A级比较，C级IL-10的表达水平显著降低（t=3.135、P＜0.05）。结果显示，随着病情进展，TNF-α的分泌逐渐增加，IL-10分泌无明显变化，提示抗炎和促炎因子之间已经出现失衡。见表4。

2.4 在肝硬化失代偿患者中MELD评分对TNF-α、IL-10分泌的影响在肝硬化失代偿患者中MELD评分＜9、9～19、19～29分的TNF-α含量比较，F=6.775，P=0.002，与A组比较，B组和C组TNF-α的含量明显增多（P＜0.05），见表5。MELD评分＜9、9～19、19～29分的IL-10含量比较，F= 3.315，P=0.051，与A组比较，B组和C组IL-10含量明显减少（P＜0.05），见表5。根据MELD评分患者的结果显示，随着评分的增加，TNF-α含量分泌逐渐增加，而抗炎因子IL-10的分泌却无明显变化，提示抗炎和促炎因子之间出现失衡。

3 讨论

GSK-3β通路在调节炎症细胞因子和抗炎症细胞因子之间的平衡中起关键作用。本研究观察了肝硬化代偿期和失代偿期患者外周血单核细胞GSK-3活性受抑制前后由LPS介导PBMCs分泌的TNF-α、IL-10表达水平的变化。GSK-3活性未抑制时，肝硬化代偿期患者、肝硬化失代偿期患者和失代偿合并腹膜炎患者3组不同的人群中，LPS均可以诱导外周血单核细胞促炎因子（TNF-α）和抗炎因子（IL-10）的分泌增加。与肝硬化代偿期患者组比较，肝硬化失代偿期合并腹膜炎组TNF-α含量明显升高，IL-10含量无变化，提示促炎细胞因子（TNF-α）过多的表达和抗炎因子（IL-10）的表达不足的特点是LPS刺激肝硬化免疫细胞的主要免疫反应特征，即肝硬化终末期患者合并感染的炎症反应表现。

为了观察GSK-3β活性对乙肝肝硬化患者外周血单核细胞LPS介导炎症反应的影响，实验中设置GSK3β特异性抑制剂SB216763和SB216763+LPS组，当预先给予SB216763处理后再予LPS刺激时细胞因子的表达发生明显变化，与LPS组比较，SB216763+LPS组即GSK-3活性受抑制后促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10表达均较受抑制前明显下降。GSK-3抑制剂通过抑制其活性从而阻断了由LPS诱导TLR4介导的信号通路（GSK-3是该信号通路的关键节点），因而信号无法向细胞核内传递从而减少TNF-αmRNA和IL-10 mRNA基因表达来调节其表达水平，结果证实GSK-3的活性调控着促炎因子和抗炎因子的平衡，从而决定了肝硬化失代偿期患者炎症反应的转归，小鼠动物实验亦有类似结果［5］。

有文献［6］报道GSK-3可以激活NF-кB，NF-кB进入核内诱导多种炎症因子的表达，包括TNF-α、IL-2、IL-1、IL-6、IFN-β等，其中TNF-α作用最为重要。促炎因子TNF-α过量表达而抗炎因子IL-10表达不足，这种趋势在肝硬化失代偿合并腹膜炎患者的PBMC中表现更加明显［7］，本实验结果表明，随着病情加重TNF-α分泌持续增加，而IL-10的分泌却无明显变化。TNF-α等炎症因子本身对组织细胞具有损伤作用［8］，同时还诱导免疫细胞产生其他炎症细胞因子及进一步刺激PBMCs产生TNF-α等促炎因子，引起级联放大效应，过量促炎细胞因子释放入血液循环产生一系列难以控制的全身瀑布式炎症反应［9］，最终导致组织器官严重损伤。GSK-3活性被其抑制剂SB216763抑制后由LPS介导的细胞信号转导通路被阻断，NF-кB活性不能被激活，继而导致由NF-кB诱导的炎症细胞因子的产生减少［10-11］，此时IL-10也能抑制由LPS介导的PBMCs产生的促炎细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6，同时可直接抑制PBMCs的活性。本实验结果显示肝硬化患者TNF-α的表达水平随Child-Pugh分级和MELD评分增加逐渐升高，而IL-10的表达水平却无明显变化。对合并和未合并腹膜炎的肝硬化失代偿患者进行了跟踪随访，发现合并感染的30例患者中有8例放弃治疗感染恶化而死亡。这从临床上验证了肝硬化失代偿期患者合并感染后易导致失控性炎症反应，如不及时有效的控制将导致患者病情恶化。

本文探讨了GSK-3在LPS诱导肝硬化患者PBMCs炎症反应中的作用，既往相关报道多是以动物为实验对象，而本研究选取了3种不同分期的肝硬化患者PBMCs为实验对象，较动物实验更具临床意义。在体外实验LPS刺激肝硬化失代偿期患者PBMCs的特征反应是促炎因子过度表达和抗炎因子表达不足，特别是在并发腹膜炎的情况下，这种特征更加明显。其机制可能与GSK-3磷酸化缺陷而活性增强有关，导致促炎因子过度分泌从而产生全身难以控制的瀑布式炎症反应。体外应用GSK3抑制剂可以明显减少促炎因子TNF-α的产生，该作用在体内环境下和体外是否相同，需要体内实验进一步证实，本研究为肝硬化失代偿期患者并发或潜在感染的治疗提供了一个新的启发，进一步的机制还有待研究［12］。

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Effects of glycogen synthase kinase-3 on lipopolysaccharide induced excessive inflammatory response in patients w ith decom pensated cirrhosis

Fan Shengchun，Xu Long，Luo Pan
（The Ninth Hospital of Nanchang Infectious Disease Hospital of Nanchang University，Nanchang 330002）

ObjectiveTo investigate the effect of Glycogen synthase kinase-3（GSK-3）on inflammatory response mediated by LPS in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of patientswith decompensated cirrhosis.MethodsPBMCs of different liver cirrhosis period patients were divided into control group，LPS group，SB216763 group and SB216763+LPS group.ELISA was used tomeasure the levels of TNF-αand IL-10 in the culture supernatant of PBMCs.ResultsThe levels of TNF-αand IL-10 in the LPSgroup were significantly higher than those of the control group（P＜0.01）.Compared with LPSgroup，SB216763+LPSgroup decreased the levels of TNF-αand IL-10 obviously in all research objects（P＜0.01）.Compared with the liver cirrhosis compensatory period patients（15），the level of TNF-αincreased obviously（P＜0.05），while the IL-10 level had no significant change in the LPSgroup of liver cirrhosis decompensated period combined with peritonitis patients（30）.The level of TNF-αand IL-10 had no obvious difference in the SB216763+LPSgroup of the two research objects.With Child-Pugh classification and MELD score increasing，the TNF-αlevel obviously raised，while the IL-10 level had no obvious change.ConclusionInhibiting the activity of GSK-3 could reduce the secretion of TNF-αand IL-10.This provides a new idea for the treatment of liver cirrhosis decompensated period combined with peritonitis patients.

GSK3；lipopolysaccharide；decompensated liver cirrhosis

R 575.2

A

1000-1492（2016）03-0406-04

时间：2016/1/28 14：23：11 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.042.html

2015-12-08接收

国家自然科学基金（编号：81160065）

南昌大学附属感染病医院（南昌市第九医院）慢性肝病科，南昌 330002

范声春，男，硕士，主治医师；徐 龙，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：xulong791@126.com