Survivin、VEGF、EGFR在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

汪 巧，胡向阳，张晓亮，丁 婧

Survivin、VEGF、EGFR在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

汪 巧1，2，胡向阳1，2，张晓亮3，丁 婧4

目的探讨存活素（Survivin）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）蛋白在甲状腺乳头状癌（PTC）中的意义。方法采用免疫组化Envision法检测100例PTC以及癌旁正常甲状腺组织中的Survivin、VEGF、EGFR蛋白表达状况。结果①Survivin、VEGF和EGFR在PTC中的阳性表达率分别为58%、75%、84%，显著高于癌旁正常甲状腺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；②Survivin和VEGF在伴有淋巴结转移的乳头状癌组织阳性表达率分别为73.3%、90%，显著高于无转移组，与其它临床病理参数无相关性；③EGFR在女性患者组织表达率为90.2%，显著高于男性患者55.6%，差异有统计学意义（P＜0.05）；④Survivin与EGFR在PTC中表达存在正相关性（χ2=5.595，P＜0.05，r=0.237）。结论Survivin、VEGF和EGFR可能参与了甲状腺乳头状癌的发生发展过程，其中Survivin和VEGF可能与肿瘤淋巴结转移有关；Survivin和EGFR可能存在协同作用。VEGF、EGFR在PTC组织中高表达，为将针对VEGF、EGFR靶点的靶向药物用于甲状腺乳头状癌治疗的构想提供了初步的实验依据。

甲状腺乳头状癌；Survivin；VEGF；EGFR

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其发病率现在以4%的增幅逐年攀升，成为近20年发病率增长最快的实体恶性肿瘤［1］。其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌中最常见的一种组织学类型，约占70%～85%。临床对于PTC的治疗主要依靠手术，而放疗、化疗基本无效，尤其是对于晚期难治的PTC患者［2］。分子靶向药物治疗成为近年来的一大热点，它具有特异性强、疗效可靠、损伤较小等优点，给甲状腺癌的治疗带来巨大的潜力和广阔的前景。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是蛋白酪氨酸激酶抑制剂作用的主要靶点，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）则是肿瘤新生血管有关的靶点，目前针对二者的靶向药物已在多种恶性肿瘤的治疗中取得了一定的疗效。调查显示国外针对VEGFR2靶点的4种靶向药物（索拉非尼、乐伐替尼、凡德尼布和卡博替尼），已获得FDA批准用于晚期甲状腺髓样癌和难治性分化性甲状腺癌的治疗，治疗结果显示明显延长患者中位无进展生存期［3］，而国内相关研究仍然较少。存活素（Survivin）参与了肿瘤组织血管的形成，其表达的组织差异性特点使其成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。该研究旨在通过观察Survivin、VEGF、EGFR三种蛋白在PTC中的表达，进而探讨三者同时在调控PTC生长、转移方面的相关意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本 收集安徽医科大学第一附属医院病理科存档的2010年1月～2013年6月的PTC手术标本病例100例（其中30例有明确的淋巴结转移）组织和100例癌旁正常甲状腺组织。

1.1.2试剂 即用型Survivin鼠抗人单克隆抗体（克隆号EP119）、即用型VEGF鼠抗人单克隆抗体（克隆号SPM225）、即用型EGFR兔抗人单克隆抗体（克隆号EP22）、EDTA修复液（pH 8.0）、PV-6000二步法免疫组化试剂盒和浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法免疫组化Envision两步法检测Survivin、VEGF、EGFR蛋白表达，按试剂盒说明书操作，使用已知阳性切片Survivin、VEGF、EGFR作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.1Survivin在PTC中的判读标准 Survivin结果判读标准（按每张切片计）：以细胞核出现棕黄色着色为阳性细胞，阳性细胞数≥10%为阳性，否则为阴性。

1.2.2VEGF、EGFR在PTC中的判读标准VEGF、EGFR结果判读标准（按每张切片计）：VEGF阳性定位于细胞质，部分可伴有细胞核着色；EGFR阳性定位于细胞膜，均为棕黄色颗粒。按染色阳性细胞数计分（5级）：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度计分（4级）：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；两积分数相乘，0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（2+），9～12为（3+）。

1.3 统计学处理使用SPSS19.0软件进行分析。采用χ2检验及Fisher精确概率法，相关性分析采用Pearsonχ2检验及列联系数。

2 结果

2.1 PTC与癌旁正常甲状腺组织Survivin、VEGF、EGFR蛋白表达状况

2.1.1Survivin蛋白的表达 Survivin在PTC中着色部位在细胞核，部分伴有细胞质着色，其在100例PTC中阳性表达率为58%，而在癌旁正常甲状腺组织未见表达（图1A、1B）。Survivin在PTC和癌旁正常甲状腺组织中的表达差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.1.2VEGF蛋白的表达 VEGF在PTC中着色部位在细胞质，部分伴有细胞核着色，其在PTC中的阳性率为75%（图1C），在癌旁正常甲状腺组织中VEGF蛋白未见表达。VEGF在PTC与癌旁正常甲状腺组织间表达差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

2.1.3EGFR蛋白的表达 EGFR在PTC中着色部位在细胞膜，部分伴有胞质着色，其在PTC中的阳性率为84%，在癌旁正常甲状腺组织中EGFR蛋白未见表达（图1D）。EGFR在PTC与癌旁正常甲状腺组织间表达差异有统计学意义（P＜0.01），各标记在PTC与癌旁正常甲状腺组织间表达情况的比较：Survivin组：χ2=81.7，P＜0.01；VEGF组：χ2=120，P＜0.01；EGFR组：χ2=144，P＜0.01，见表1。

2.2 PTC中Survivin、VEGF、EGFR蛋白的表达与临床病理参数间的关系Survivin和VEGF在伴有淋巴结转移组的表达率高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0.05），与患者年龄、性别和肿瘤大小无相关性；EGFR在女性患者肿瘤组织中表达高于男性患者，差异有统计学意义（P＜0.05），与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移均无相关性。见表2。

2.3 PTC中Survivin、VEGF、EGFR蛋白表达的相关性Survivin、VEGF、EGFR三种蛋白在PTC组织中表达的相关性（表3）。PTC中VEGF与Survivin、EGFR的蛋白表达无相关性；Survivin与EGFR的蛋白表达存在关联（χ2=5.595，P＜0.05，r= 0.237）。

3 讨论

Survivin是迄今发现最强的一种凋亡抑制因子，其作用远远大于B细胞淋巴瘤/白血病-2即bcl-2家族的作用。其主要通过两种途径抑制细胞凋亡：①与细胞周期蛋白激酶p34dc2及p34edk4发生作用，阻断凋亡通路信号的转导［4］；②直接通过抑制凋亡终末效应器Capase3和Capase7的活性，阻断各种细胞凋亡过程［5］。此外，VEGF可上调血管内皮细胞中Survivin的表达，上调后的survivin以多种方式接受来自VEGF的信号，抑制血管内皮细胞的凋亡，借以维持VEGF诱导肿瘤血管生成的过程。大量研究［6］表明，Survivin在多种恶性肿瘤中表达，如乳腺癌、喉鳞状细胞癌等，并且与肿瘤的恶性程度和预后有重要关系。分子生物学的研究［7］下调癌细胞株Survivin不仅加速细胞凋亡，同时能增强其对化疗药物的敏感性。本实验结果显示Survivin在PTC的阳性表达率为58%，显着高于癌旁正常甲状腺组织，提示Survivin可能参与PTC的发生发展过程，且Survivin表达还与淋巴结转移有关，即发生淋巴结转移的病例表达率明显高于未发生淋巴结转移的病例（P＜0.05），提示Survivin的高表达可能还与肿瘤的转移及患者的预后密切相关。在本实验中Survivin阳性主要定位于细胞核，部分伴有胞质着色，通常情况下，Survivin表达于癌细胞的胞质中，但对生长增殖旺盛的细胞也会在细胞核中表达［8-9］，研究［10］表明细胞质中表达的Survivin主要是通过促进肿瘤细胞的凋亡达到细胞保护功能，而细胞核中表达的Survivin蛋白主要是通过控制细胞分裂发挥作用，Survivin定位于细胞核常提示着肿瘤预后较差。

VEGF是重要的促血管生成因子，也是最强力的血管生成诱发剂，能通过旁分泌功能刺激血管内皮细胞增殖和迁移，促进肿瘤新生血管生成［11］。研究［12］表明，VEGF在多种人类肿瘤组织，包括甲状腺癌中存在高表达。目前，在对VEGF以及相关的抑癌基因、基质酶类的相互作用深入研究的前提下，认为VEGF与甲状腺肿瘤的生长和转移密切相关，在其发生、发展和浸润等生物学行为中发挥重要作用，且VEGF表达水平越高，恶性程度也越高［13］。本实验中，VEGF在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率为75%，显着高于癌旁正常甲状腺组织。表明VEGF对甲状腺乳头状癌诊断有较好的提示意义。VEGF在乳头状癌有淋巴结转移组中的阳性表达率为90.0%，高于无淋巴结转移组的68.6%（P＜0.05），说明PTC发生、发展及淋巴结转移与VEGF有关。

EGFR是原癌基因C-erB-1的表达产物，在正常生理情况下作为一类具有酪氨酸激酶活性的膜受体，是细胞表面的传感器，EGFR与其配体结合后，成为细胞生长信号的发放者，调控细胞的增殖、黏附、转移和分化过程。目前，在甲状腺癌未分化癌、滤泡癌和髓样癌中检测到EGFR的高表达，但并未检测到相一致的EGFR基因突变。在本实验中使用的为EGFR扩增型蛋白抗体，实验结果显示EGFR在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率为84%，显着高于癌旁正常甲状腺组织，提示EGFR在PTC的发生发展过程中发挥重要作用。此外本实验中，EGFR在女性PTC患者的表达水平明显高于男性患者，女性PTC患者雌激素水平较高，推测可能是EGFR与雌激素相互作用的结果。

综合实验结果推测：VEGF、EGFR蛋白在PTC组织高表达，为临床上将相应靶向药物应用于PTC治疗的构想提供了初步的实验依据，随之可能带来的临床治疗价值值得进一步深入讨论。肿瘤是一种多因素并受多种信号影响的疾病，癌细胞容易对高选择性抑制剂产生耐药性，因而能阻断多个细胞生长的信号转导通路的多靶点激酶抑制剂在临床上往往能取得更好的治疗效果，这成为肿瘤治疗和靶向药物研发的新趋势。分析Survivin、VEGF、EGFR三者在PTC表达的相关性，结果显示Survivin和EGFR呈正相关性，提示在甲状腺乳头状癌的增殖、浸润和转移过程中Survivin和EGFR可能存在协同作用，但目前对于二者具体相互作用机制尚未阐明。Wang et al［14］抑制EGFR高表达细胞株PI3激酶通路，检测到Survivin蛋白水平明显降低，而抑制MAP激酶途径不影响Survivin蛋白水平，证实EGFR激活后影响PI3激酶通路从而影响Survivin蛋白的表达。研究中未显示在PTC中VEGF与Survivin、EGFR存在相关性，与部分文献提到的研究结果不完全相符，这可能与本实验的标本量过小，实验方法有一定差异有关。由于蛋白的表达和本身构象的高度不稳定性，需要进一步从DNA水平对PTC中Survivin、EGFR、VEGF的表达进行研究，从而达到“标本兼治。

［1］ 罗盛兰，俞 敏，龚巍巍，等.甲状腺癌的流行现状及其危险因素［J］.中国预防医学杂志，2013，14（4）：317-20.

［2］ 张晓亮，胡向阳，杨 懿，等.HER-2、CyclinD1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义［J］.安徽医科大学学报，2014，49（7）：958 -61.

［3］ 杨中元，王 羲，李 茵，等.甲状腺癌靶向治疗进展［J］.中国普外基础与临床杂志，2015，22（7）：803-10.

［4］ Suzuki A，Hayashida M，Ito T，et al.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16（INK4a）and Cdk2/cyclin E complex activation［J］.Oncogene，2000，19（29）：3225-34.

［5］ Shin S，Sung B J，Cho Y S，et al，An anti-apoptosis protein human surviving is a direct inhibitor of capase3 and 7［J］.Biochemistry，2001，40（4）：1117-23.

［6］ Gorgun D，Secik F，Midili K，et al.Diagnostic and prognostic significance of surviving levels in malignant pleural effusion［J］. Resoir Med，2013，107（8）：1260-5.

［7］ 韩 芳，黎 莉.靶向Survivin反义寡核苷酸对MCF-7乳腺癌细胞系Survivin mRNA及紫杉醇药物敏感性的影响［J］.山东大学学报，2008，46（1）：36-9.

［8］ Kim Y A，Chang M，Park Y J，et al.Detection of surviving and COX-2 in thyroid carcinoma：anaplastic carcinoma shows overexpression of nuclear surviving and low COX-2 expression［J］.Korean JPathol，2012，46（1）：55-60.

［9］ Necochea-Campion R D，Chen C S，Mirshahidi S，etal，Clinicalpathologic relevance of Survivin spice variant expression in cancer［J］.Cancer Lett，2013，339（2）：167-74.

［10］ngels K，Knauer S，Metzler D，et al，Dynamic intracellular Survivin in oral squamous cell carcinoma：underlyingmolecularmechanism and potential as an early prognostic marker［J］.Pathol，2007，211（5）：532-40.

［11］吴伟群，何小杰，李延辉，等.VEGF在甲状腺肿瘤中的表达及与肿瘤血管生成的关系［J］.中国医药科学，2013，3（12）：23-5.

［12］Zheng SQ，Huang PQ，Zhang Y J，et al，Role ofmatrixmetalloproteinase（MMP）-2 and-9 and vascular endothelial growth factor C in lymph nodemetastasis of breast cancer［J］.中华病理学杂志，2010，39（4）：240-4.

［13］Zhou Z H，Cui X N，Xing H G，et al.Changes and prognostic value of serum vascular endothelial growth factor in patients with differentiated thyroid cancer［J］.Med Prince Pract，2013，22（1）：24-8.

［14］Wang Q，Mark I，Greene.EFGR enhances Survivin expression through the phosphoinositide 3（PI-3）kinase signaling pathway［J］.Experimental and Molecular Pathology，2005，79，（2）：100 -7.

Expression and significance of Survivin，VEGF and EGFR in papillary thyroid carcinoma

Wang Qiao1，2，Hu Xiangyang1，2，Zhang Xiaoliang3，et al
（1Dept of Pathology，AnhuiMedical University，Hefei 230032；2Dept of Pathology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；3Dep of Pathology，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001）

ObjectiveTo explore the significance of Survivin protein，EGFR protein and VEGF protein in papillarythyroid carcinoma（PTC）.MethodsImmunohistochemical staining was performed in 100 specimens of PTC and 100 specimens of adjacent normal thyroid tissue to examine the expression of Survivin protein，VEGF protein and EGFR protein.Results①The positive ratios of Survivin，EGFR and VEGF in PTC were 58%，75%and 84%，which were significantly higher than the expression levels of adjacent normal thyroid tissue.Therewas all statistical difference between them（P＜0.05）.②The positive ratios of Survivin and VEGF in PTC with lymph nodemetastasiswere 73.3%and 90%，which were prominently higher than those without lymph nodemetastasis.No relationships were found between expression of the makers and other clinicopathological features in PTC.③The positive expression rates of EGFR in female patients was 90.2%，dramaticlly higher than that ofmale patients 55.6%. There was statistical difference between them（P＜0.05）.④The expressions of Survivin and VEGF were positively correlated in PTC（χ2=5.595，P＜0.05，r=0.237）.ConclusionThe Survivin，VEGF and EGFR may be involved in the occurrence and development process of PTC，Moreover，Survivin and VEGFmay promote the procedure of cancer cell spreading to lymph nodes；theremay exist synergistic effectbetween Survivin and EGFR.The over expression of Survivin，VEGF and EGFR in PTCmay provide preliminary experimental basis for the treatmentof PTC，which using corresfncollege targeted drugs.

papillary thyroid carcinoma；Survivin；VEGF；EGFR

R 736.1

A

1000-1492（2016）03-0442-05

时间：2016/1/28 14：23：11 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.060.html

2016-01-18接收

国家临床重点专科建设项目经费资助（编号：3101005004021）

1安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032

2安徽医科大学第一附属医院病理科，合肥 230022

3安徽省立医院病理科，合肥 230001

4安徽省胸科医院，合肥 230020

汪 巧，女，硕士研究生；

胡向阳，女，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：yfhxy2013@163.com