香菇、灵芝多糖硒配合工艺的研究*

孙浩然孟庆彬郭　兴

（1.伊春林业管理局，黑龙江　伊春　153000；2.伊春林业科学院，黑龙江　伊春　153000）



香菇、灵芝多糖硒配合工艺的研究*

孙浩然1孟庆彬2郭兴2

（1.伊春林业管理局，黑龙江伊春153000；2.伊春林业科学院，黑龙江伊春153000）

摘要：通过单因素和正交试验，以硒螯合率为评价指标，分析了多糖浓度、pH值、亚硒酸钠浓度、温度4个因素对香菇和灵芝粗多糖硒螯合效率的影响，确定多糖硒配合物制备的最佳工艺条件。结果表明，优化的香菇多糖硒配合物合成工艺为：多糖浓度2 mg/mL，pH值5.0，亚硒酸钠浓度6 mg/mL，温度80℃；灵芝多糖硒配合物的最优合成工艺为：多糖浓度2 mg/mL，pH值5.0，亚硒酸钠浓度4 mg/mL，温度为60℃。

关键词：香菇；灵芝；多糖；Se；螯合

*黑龙江省森林工业总局应用研究项目（sgzjY2011020）

香菇和灵芝是两种较为常见的食用菌，其中含有大量生物活性成分——多糖；而多糖具有多种药理功能，可抑制肿瘤的发生、发展与转移，调节人体免疫功能，抗衰老[1 - 3 ]。硒多糖的研究在国内外少见报道，但由于其独特的生理活性，已经成为近年来研究的热点。

本研究通过单因素试验，以硒螯合率为评价指标，分析了多糖浓度、pH值、亚硒酸钠浓度和温度4因素对香菇、灵芝粗多糖硒螯合效率的影响；根据单因素试验结果，进行3水平正交试验。以多糖硒螯合率为指标，确定多糖硒配合物制备的最佳工艺条件，为香菇多糖和灵芝多糖补硒剂的开发与利用奠定基础。

1　试验材料与方法

1.1材料与仪器

试验用香菇和灵芝菌株为9608和G9；葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、亚硒酸钠、冰乙酸、氯仿、正丁醇、盐酸等，均为分析纯，北京化工厂制品；硒标准液（1 000 mg/L），中国计量科学研究院提供。

HZ- 2111KB立式震荡培养箱，金坛市盛蓝仪器制造有限公司出品；BAO- 35A精密鼓风干燥箱，施都凯仪器设备（上海）有限公司出品；TU- 1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司出品；AA- 6800型原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司出品。

1.2香菇多糖和灵芝多糖的制备

将菌株接种于CYM培养基中，于28℃、150 r/min恒温摇床培养，将获得的菌丝体过滤、烘干；再置于85℃水浴锅中浸提5 h，调节pH值至7.0，离心得上清液。利用旋转蒸发仪减压浓缩上清液后，以3倍体积的75%乙醇醇沉浓缩液中的多糖，4℃静置过夜后，倾去醇沉多糖的上清液，3 000 r/min离心10min后分级沉淀法纯化粗多糖，真空干燥[4- 5]。将干燥的多糖溶于水，扎袋流水透析除盐后，透析液经减压浓缩、醇析、离心、真空干燥，得精制多糖。蒽酮比色法测定多糖含量[6]。

式中，C为提取溶液中粗多糖浓度(mg/mL)；V为提取溶液总体积(mL)；M为提取菌丝体干重(mg)。

1.3单因素对硒螯合率的影响试验设计

多糖浓度称取亚硒酸钠，溶于30 mL蒸馏水中，配成浓度为6 mg/mL的溶液；另准确称取适量的多糖放入其中，分别配制成多糖浓度为2、4、6、8、10 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值为6；70℃水浴2 h后，加无水乙醇醇沉，再离心、扎袋流水透析除盐，经反复醇沉、真空干燥，最终制得多糖硒配合物，进行硒(Se)含量的测定。

pH值称取亚硒酸钠溶于30 mL蒸馏水中，配成浓度为6 mg/mL的溶液；另准确称取适量的多糖放入其中，配制成多糖浓度为4 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值为分别为3、4、5、6、7。后续其它操作同上。

亚硒酸钠浓度称取亚硒酸钠溶于30 mL蒸馏水中，配成浓度为2、4、6、8、10 mg/mL的溶液；另准确称取适量的多糖放入其中，配制成多糖浓度为4 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值为6。后续其它操作同上。

温度称取亚硒酸钠溶于30 mL蒸馏水中，配成浓度为6 mg/mL的溶液，另准确称取适量的多糖放入其中，配制成多糖浓度为4 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值为6。分别在温度为40、50、60、70、80℃水浴2 h后，进行后续操作（同上）。

1.4正交优化试验

根据单因素试验结果，分别选取4因素的3个水平进行L9(34)正交试验（表1），以多糖硒螯合率为指标，确定最佳工艺条件。

1.5多糖硒配合物中硒含量测定方法

制作硒标准曲线：准确量取硒标准溶液1 mL，用纯水定容至1 000 mL，得浓度为1 μg/mL的母液；分别量取母液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，并定容至10 mL，得Se浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 μg/mL。用石墨炉原子吸收分光光度计测定其吸光度值，并计算出回归方程和相关系数。

表1　正交试验设计

硒多糖溶液的配制：精确称取硒多糖0.1 g，加纯净水定容至100 mL于容量瓶中；然后分别取0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL容量瓶中，用纯净水定容至刻度。用石墨炉原子吸收检测Se2+的浓度[ 7 ]。螯合率的计算

式中，A为硒螯合率(%)；C0为螯合前溶液中硒离子浓度（mg/mL）；C为螯合后溶液中硒离子浓度（mg/mL）。

2　结果与分析

2.1香菇多糖和灵芝多糖含量的测定

由300 mL CYM培养基中产出香菇9608和灵芝G9菌丝体，干重分别为2.04 g和3.55 g；经热水煮沸法提取多糖，再通过分级沉淀法纯化透析后分别得精多糖0.36g和0.49g，多糖得率分别为7.2% 和4.7%。620 nm波长下由蒽酮硫酸法测定可溶性多糖的含量，标准曲线回归方程为Y=0.753 4X+ 0.0432（R2=0.9933）。

2.2香菇多糖和灵芝多糖硒配合物单因素分析2. 2. 1多糖浓度对硒螯合率的影响

香菇多糖硒螯合率在多糖浓度为4 mg/mL时硒螯合率最大为14.57%，当反应液多糖浓度由6 mg/mL增加至10 mg/mL时硒螯合率略有降低；灵芝多糖硒螯合率在多糖浓度为4 mg/mL时硒螯合率最大为12.22%，当反应液多糖浓度从6 mg/mL增加至10 mg/mL时硒螯合率略有降低（图1）。当多糖浓度增加到一定量时，反应液中达到饱和，继续增加多糖可能会阻碍多糖与金属离子的螯合，为正向饱和后出现的解离现象。

图1　多糖浓度对硒螯合率的影响

从螯合率和成本上考虑，香菇多糖硒最佳多糖浓度取4 mg/mL；灵芝多糖硒最佳多糖浓度为4 mg/mL。

2.2.2 pH值对硒螯合率的影响

香菇多糖硒螯合率随着pH值的升高而增大，反应液pH值为3时硒螯合率为7.20%，当pH值增大到6时硒螯合率为8.16%，但当pH值为7时硒螯合率降低了0.63%；灵芝多糖硒螯合率随着pH值的升高而增大，反应液pH值为3时硒螯合率为5.13%，pH值增大到5时硒螯合率为6.60%，当pH值为7时硒螯合率降低了0.75%（图2）。

试验结果显示，反应液的pH值对Se2+离子强度有一定影响。pH值过大，会使阴离子与多糖分子的活性基团发生竞争作用，进而阻碍配合物的形成；pH值过小，反应液中生成的氢离子增多，导致硒离子螯合不完全。从图2可以看出，香菇多糖硒螯合最佳pH值为6；灵芝多糖硒螯合最佳pH值为5。

图2　 pH值对硒螯合率的影响

2. 2. 3亚硒酸钠浓度对硒螯合率的影响

香菇多糖硒螯合率在亚硒酸钠浓度为2、4、6 mg/mL时，随着亚硒酸钠浓度的增加而增大，浓度为6 mg/mL时硒螯合率最大为8.10%，当浓度增加至10 mg/mL时，硒螯合率逐渐降低（图3）；灵芝多糖硒螯合率在亚硒酸钠浓度为4 mg/mL时，硒螯合率最大为5.61%，当浓度从4 mg/mL增至10 mg/mL时硒螯合率逐渐降低。

图3　亚硒酸钠浓度对硒螯合率的影响

当亚硒酸钠浓度增加到一定量时，反应液中达到饱和，继续增加亚硒酸钠可能会阻碍多糖与金属离子的螯合，为正向饱和后出现的解离现象。从图3中可以看出，香菇多糖硒最佳亚硒酸钠浓度为6 mg/mL；灵芝多糖硒最佳亚硒酸钠浓度为4 mg/mL。

2.2.4温度对硒螯合率的影响

香菇多糖硒和灵芝多糖硒螯合率均随着温度的升高而增大，温度为70℃时硒螯合率最大，分别为7.88%和5.03%；当反应液温度升高至80℃时硒螯合率逐渐降低（图4）。

一定范围内的温度升高，有利于溶液中的分子运动，使螯合率升高，但反应液温度过高时，分子运动增强，离子振动剧烈，不利于多糖配体与聚合硒核间接触发生配合。从图4中可以看出，香菇多糖硒和灵芝多糖硒的最佳螯合温度均为70℃。

图4　温度对硒螯合率的影响

2. 3正交试验结果分析

根据表2得知，各因素影响香菇多糖硒螯合率的主次顺序是A＞C＞D＞B，说明在此正交试验中，多糖浓度对香菇多糖硒螯合率的影响最大，pH值的影响最小。

表2　香菇多糖硒螯合正交试验结果

最优水平为A1B1C2D3，即多糖浓度为2 mg/mL，pH值为5.0，亚硒酸钠浓度为6 mg/mL，温度为80℃；在最佳条件下香菇多糖硒螯合率可达到23.16%。

表3　灵芝多糖硒螯合正交试验结果

由表3可知，各因素影响灵芝多糖硒螯合率的主次顺序是A＞D＞C＞B，即多糖浓度对灵芝多糖硒螯合率影响最大，其次是温度，再次是亚硒酸钠浓度，最后是pH值。

最优水平为A1B1C1D1，即多糖浓度为2 mg/mL，pH值为5.0，亚硒酸钠浓度为4 mg/mL，温度为60℃。在最佳条件下灵芝多糖硒的螯合率可达到12.90%。

3　结　论

3.1通过对香菇和灵芝菌丝体多糖的提取试验，结果多糖得率分别为7.2%和4.7%。

3.2单因素试验分析结果显示，各因素影响香菇多糖硒螯合率的主次顺序是：多糖浓度＞亚硒酸钠浓度＞温度＞pH值；影响灵芝多糖硒螯合率的主次顺序是：多糖浓度＞温度＞亚硒酸钠浓度＞pH值。

3.3正交试验优化出的香菇多糖硒配合物合成工艺为：多糖浓度2 mg/mL，pH值5.0，亚硒酸钠浓度6 mg/mL，温度80℃；灵芝多糖硒配合物合成工艺为：多糖浓度2 mg/mL，pH值5.0，亚硒酸钠浓度4 mg/mL，温度60℃。

参考文献

［1］李小定,荣建华,吴谋成.真菌多糖生物活性研究进展［J］.食用菌学报, 2002, 9（14）: 50 - 58.

［2］陈春霞.猪苓多糖体的药理研究及临床应用初探［J］.中草药, 1985, 16（4）: 40.

［3］贺青提,张松.食(药)用菌多糖免疫增强作用机制的研究进展［J］.食用菌学报, 2004, 11（2）: 52.

［4］卢日峰,王欣,郭丽，等.两种方法纯化香菇多糖的对比研究［J］.中国实验诊断学, 2008, 12（4）: 488 - 490.

［5］缪建,杨文革,周彬,等.香菇多糖提取分离的研究［J］.生物加工过程, 2007, 5（3）: 74 - 78.

［6］陈毓荃.生物化学试验方法和技术［M］.北京：科学出版社, 2002.

［7］高淑云,马亚东.返魂草中硒多糖及硒元素含量的测定［J］.时珍国医国药, 2009, 20（11）: 2 763 - 2 764.

（责任编辑：潘启英）

Study on the Selenium and Selenium Complex Process of Mushroom and Ganoderma lucidum

SUNHaoran
（Forestry Administration Bureau, Heilongjiang YiChun 153000）

Abstract Through single factor and orthogonal experiments, using selenium chelate rate as the evaluation index, analysis of the polysaccharide concentration, pH value, effect of sodium selenite concentration and temperature of Lentinus edodes and Ganoderma lucidum crude organoselenium sugar chelating efficiency to determine selenium polysaccharide with the optimum conditions of the preparation. With the optimization results of lentinan selenium polysaccharide concentration was 2 mg / mL, pH value of 5.0 for the synthesis process, sodium selenite concentration 6 mg / mL, temperature of 80 DEG C; Ganoderma lucidum polysaccharide selenium with the synthesis process for polysaccharide concentration was 2 mg / mL, the pH value was 5.0, sodium selenite concentration of 4 mg / mL temperature 60 degrees.

Key words Mushrooms；Ganoderma lucidum；Polysaccharide；Se；Chelate

收稿日期：2015 - 09 - 23

作者简介：第1孙浩然（1963-），男，硕士，高级工程师，伊春林业管理局副局长。

文章编号：1001 - 9499（2016）01 - 0035 - 04

中图分类号：S646. 1+2, S567. 3+1, Q946

文献标识码：A