糖肾煎对早期2型糖尿病肾病大鼠8-异前列腺素2α的影响*

胡爱民，晏 玲，张利芳，赵 静，张显林，万巧巧

(武汉市中医医院内分泌科，武汉 430014)

糖肾煎对早期2型糖尿病肾病大鼠8-异前列腺素2α的影响*

胡爱民，晏 玲，张利芳，赵 静，张显林，万巧巧

(武汉市中医医院内分泌科，武汉 430014)

目的:探讨8-异前列腺素2α(8-iso-PGF2α)与早期2型糖尿病肾病(DN)相关性及中药糖肾煎对其影响。方法:采用单肾切除+高脂饲料+小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射，结合行为干预建立早期(气阴两虚型)2型糖尿病肾病病证结合大鼠模型，按随机数字表法分为假手术组(A组)、模型组(B组)、糖肾煎组(C组)、贝那普利组(D组)。干预16周，观察各组大鼠一般状况和空腹血糖(FBG)、负荷后血糖(P2hBG)、空腹胰岛素(FINS)、负荷后胰岛素(P2hINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、24 h尿白蛋白(24h-UAlb)、尿β2微球蛋白(U-β2MG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、血浆及尿液8-iso-PGF2α、肾小球体积(GV)及基底膜厚度(GBM)。结果:与 A组比较，B组大鼠一般状况差，FBG、P2hBG、FINS、P2hINS、HOMA-IR、24h-UAlb、U-β2MG、血、尿8-iso-PGF2α水平指标均有明显上升、GV增大及GBM增厚;与B组比较，C组一般状况明显改善，各指标均有改善且GV增大减轻、GBM增厚减轻;与D组比较，C组一般状况改善较明显，HOMA-IR改善更明显，余指标无明显差异。结论:8-iso-PGF2α与早期(气阴两虚型)2型糖尿病肾病有相关性，糖肾煎对其有改善、保护肾脏的作用。

8异前列腺素2α;2型糖尿病肾病;糖肾煎

1 材料与方法

1.1 动物及饲料

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量100～120g，购自湖北省疾病控制中心实验动物中心。高脂饲料由基础饲料、猪油、胆固醇粉、胆酸钠粉按 87.5%、10%、2%、0.5%比例混合而成。

1.2 药物及试剂

益气养阴中药复方糖肾煎由生黄芪、太子参、生地黄、山药、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七等中药组成，用水煮醇提法制备成浸膏，用生理盐水稀释成生药浓度为2.5 g/ml溶液。贝那普利由诺华制药公司提供，用生理盐水稀释成浓度为2.0mg/ ml溶液。STZ产自美国Sigma公司，以0.1mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH=4.4)配成2.0%STZ溶液。强生稳豪倍优血糖仪，由强生(中国)医疗器械有限公司提供;血糖试剂盒购自南京建成生物工程研究所;INS、β2MG试剂盒购自深圳新产业生物医学工程股份有限公司;BUN、Cr试剂盒购自北京恩济和生物有限公司;UAlb试剂盒购自山东博科生物产业有限公司;8-iso-PGF2a试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司。

1.3 分组及处理

采用单肾切除+高脂饲料+小剂量(STZ)腹腔注射，结合行为干预喂养方式，建立早期(气阴两虚型)DN大鼠模型［2］。SPF级 Wistar大鼠适应性喂养10 d，采用随机数字表法分为模型制备组和假手术组(A组)，模型制备组以1%戊巴比妥钠30mg/ kg腹腔注射麻醉，切除左肾，缝合切口，青霉素抗感染共1周。A组大鼠仅暴露左肾后即缝合。模型制备组给予高脂饲料，A组给予基础饲料，均自由饮水，喂养2周。模型制备组腹腔注射STZ 30 mg/kg，A组注射等量0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。72 h后行OGTT试验，剪尾取血，化学法检测血糖，以FBG≥5.6 mmol/L、P2hBG≥7.8 mmol/L为造模初步成功，再用随机数字表法分为B组、C组、D组。C组用糖肾煎、D组用贝那普利分别以10 g/kg·d、10 mg/kg·d灌胃，每日1次，连续16周;A组和 B组灌等体积饮用水。期间B组、C组和D组结合饥饱失常(单日禁食，自由饮水;双日不限量给予高糖高脂饲料，自由饮水)、过度疲劳(每天于 43±0.5℃、水深35 cm的恒温水槽中游泳，当大鼠出现自然下沉时从水槽取出，每日1次)、惊吓(猫叫声惊吓鼠、棍棒敲击鼠笼，每日1次)的方式行为干预，同时实施4周。实验结束前1周采用金属代谢笼收集24 h尿标本。实验结束前1 d行OGTT及胰岛素释放试验。实验结束，观察各组大鼠一般状况，禁食12～14 h称重，以戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血分离血清备用。取右肾并称重，取部分肾组织分别固定于4%多聚甲醛溶液(光镜标本)和2.5%戊二醛溶液(电镜标本)备用。取部分肾皮质称重，在冰浴条件下制成匀浆氯化钠液，离心取上清液，－20℃保存备用。

1.4 检测方法

FBG、P2hBG用葡萄糖氧化酶法;INS采用化学发光法;24 h-UAlb用免疫透射比浊法，U-β2MG用化学发光法;BUN用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法;Cr用酶法;8-iso-PGF2a采用酶联免疫吸附法，均严格按试剂盒说明书操作。HOMA-IR=(FBG×FINS)/ 22.5。组织标本分别常规固定、脱水、包埋、切片，光镜采用HE染色，电镜采用铀铅双染色。光镜400倍摄片，运用Image pro-plus 6.0采用逐点描绘区域法，用鼠标沿肾小球毛细血管丛逐点描画出整个肾小球轮廓，测量肾小球面积(Area)。按公式 GV= Area1.5×0.75+0.21计算，每例随机选10～12个完整肾小球测量，取其平均值。电镜2500倍摄片，运用Image pro-plus 6.0软件分析GBM，每组片子选3张具有完整组织的照片，每张照片测3个GBM厚度，并计算其平均值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，计量资料方差齐采用t检验，方差不齐采用t＇检验。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、FBG、P2hBG、FINS、P2hINS及HOMA-IR结果比较(表1)

2.2 各组大鼠 24h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat、肾重/体质量结果比较(表2)

表1 各组大鼠体质量、FBG、P2hBG、HOMA-IR比较

表2 各组大鼠24h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat及肾重/体质量比较

2.3 各组大鼠血清及尿液8-iso-PGF2a比较(表3)

2.4 各组大鼠肾小球体积及基底膜厚度(表4)

表3 各组大鼠血清及尿液8-iso-PGF2a比较

表4 各组大鼠肾组织肾小球体积及基底膜厚度比较

2.5 各组大鼠镜下组织病理变化(图1、2)

图1 各组大鼠肾组织光镜下病理变化(HE染色400×)

2.6 各组大鼠一般状况

A组大鼠饮食、尿量正常，大便黑褐色颗粒状，肌肉丰满，毛发洁白顺滑，精神饱满，双目有神，反应灵敏，舌淡红润泽;B组大鼠气阴两虚表现明显，饮食、尿量增多、消瘦，拉尾排便、排尿，倦怠懒动、喜蜷卧或成堆趴卧，少数急躁易怒、易惊恐斗殴、毛色暗黄无光泽、舌胖大少津等;C组大鼠上述状况均有明显改善;D组大鼠上述状况有一定程度改善。

图2 各组大鼠基底膜透射电镜下病理变化(铀铅双染色2500×)

3 讨论

Brownlee提出糖尿病并发症的统一机制学说，即经典的多元醇途径、糖基化终末产物(AGES)途径、蛋白激酶C(PKC)途径和氨基己糖途径，均是高糖环境下线粒体呼吸链中氧自由基生成过多的结果，即高糖损伤的共同基础是氧化应激［3］。氧自由基不仅直接损伤肾组织肾细胞膜、肾细胞及线粒体DNA等，而且氧自由基作为信号分子激活细胞内多个信号通路，使肾小球出现高灌注、高滤过及GV肥大、GBM增厚、细胞外基质过度沉积、足细胞损伤、蛋白尿形成和肾功能损害。8-iso-PGF2a是自由基攻击生物膜磷脂中花生四烯酸发生脂质过氧化后的特异性产物，在氧化应激水平升高情况下大量生成，且结构稳定［4］，是评价氧化应激理想的生物指标。Decfistofaro［5］和 Hoeldtke［6］等通过检测糖尿病患者血或尿8-iso-PGF2a得出其含量与患者的病情、胰岛素抵抗及预后存在相关性的结论。另一方面，Anila Kumar［7］等发现，在炎症反应早期，8-iso-PGF2α可通过直接或第二信使系统促使单核细胞黏附于微血管内皮细胞，导致内皮受损;T.Mueller［8］等发现，8-isoPGF2α本身又可以刺激血管内皮细胞分化DNA的合成和内皮素-1的表达，削弱NO保护内皮的生物效应，进一步加重内皮损伤;牟海英［9］等综述国内外研究成果认为，8-iso-PGF2α是一种强力的血管收缩剂，能选择收缩肾血管、心脏冠状动脉、脑血管、视网膜动脉和肺血管等;促进血小板的黏附、聚集和变形并加速凝血，引起成纤维细胞和心肌细胞的增殖和分化。因此，8-iso-PGF2α可能是DN早期微量蛋白尿的原因之一，并与其他因素一起参与肾小球硬化，但其具体作用机制尚有待进一步研究。

DN属于中医“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴。早期以气阴两虚为主［10］。笔者临床用经验方“糖肾煎”进行治疗取得较好效果，方中黄芪、太子参、山药健脾益气，其中黄芪可利水消肿;生地清热凉血、养阴生津;山茱萸补益肝肾、收敛固涩;茯苓健脾渗湿、利水消肿;丹皮清热凉血、活血化瘀;三七止血散瘀、补虚消肿;五味子益气生津、补肾宁心，全方共奏补益脾肾、益气养阴、活血通络之功。

本研究中模型组大鼠一般状况差，糖代谢紊乱，HOMA-IR、24h-UAlb、U-β2MG升高，GV肥大，GBM增厚，肾功能尚正常，符合早期(气阴两虚型)2型糖尿病肾病特点。观察发现，其血、尿8-iso-PGF2α升高，证实其与早期糖尿病肾病有相关性。中药糖肾煎干预后一般状况好转，各项指标改善，血、尿8-iso-PGF2a下降，DN进程得到改善。因此，我们认为中药复方糖肾煎对保护肾脏的作用可能是通过改善氧化应激、影响8-iso-PGF2α等途径实现的。

［1］Morrow JD.Quantification of isoprostanes as indices of oxidant stress and the risk of atherosclerosis in humans［J］.Arterioscler Thromb Vasc Bio，2005，25:279-286.

［2］胡爱民，晏玲，张利芳，等.2型糖尿病肾病气阴两虚型动物模型的建立及评价［J］.中国中医基础医学杂志，2015，21(10): 1251-1253.

［3］王艳桥，徐向进，陈频.氧化应激研究进展及其在糖尿病肾病发病中的作用［J］.医学综述，2010，16(11):1681-1684.

［4］Morrow JD，Roberts LJ.Mass spectrometric quantification of F2-iso-prostanes in biological fluids and tissues as measure of oxidantstress［J］.Methods Enzymo，1999，300:3-12.

［5］Decristo faror，Roccab，Vitacolonnae，etal.Lipid and protein oxidation contribute to a prothrombotic state in patients with type 2 diabetes mellitus［J］.ThrombHaemost，2003，1(2):250-256.

［6］Hoeldtke rd，BRYNER KD，MCNEILLDR，etal.Oxidative stress and insulin requirements inpatient wi-th recent on set type 1diabetes［J］.Clin Endocrinol Metab，2003，88(4):1624-1628.

［7］Kumar A，Kingdon E，Norman J，et al.The isoprostane 8-iso-PGF2alpha supresses monocyte adhe-sion to human microwascular endothelial cells via two independent mechanisms［J］.The FASEBJournal，2005，19:443-445.

［8］Mueller T，Dieplinger B，Gegenhuber A，et al.Serum total 8-isoprostaglandin F2α: a new and in-dependent predictor of peripheral arterialdisease［J］.JOURNAL OF VASCULAR SURGERY，2004，40(4):768-773.

［9］牟海英，马静.8.异前列腺素 F2a与氧化应激损伤性疾病的研究进展［J］.医学综述，2007，34(6):377-381.

［10］中华中医药学会.糖尿病中医防治指南［M］.北京:中国中医药出版社，2007:6-14.

The influence of Tangshenjian to Early type 2 Diabetic Nephropathy Rats’8-iso-Prostaglandin 2α

HU Ai-min，YAN Lin，ZHANG Li-fang，ZHAO Jing，ZHANG Xian-lin，WAN Qiao-qiao
(Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medcine Endocrinology，Hubei Wuhan 430014，China)

Objective:To investigate the correlation between 8-iso-prostaglandin 2α(8-iso-PGF2α)and Diabetic nephropathy(DN)rats and medicine Tangshenjian’intervention.Methods:Use a single nephrectomy+high-fat diet+lowdose streptoz-otocin(STZ)intraperitoneal injection，combined with behavior intervention，the establishment of early (QiYin Deficiency)type 2 diabetic nephropathy disease and syndrome rats were randomly divided sham operation group (groupA)，model group(group B)，sugar，Tangshenjian group(group C)，benazepril group(group D).Intervention 16 weeks，Observe the general situation、fasting blood glucose(FBG)，2 hours postprandial blood glucose(P2hBG)，fasting serum insulin(FINS)，afterload serum insulin(P2hINS)，Insulin resistance index(HOMA-IR)，24 h urinary albumin (24h-UAlb)，urinary β2 microglobulin(U-β2MG)，blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，plasma and urinary 8-iso-PGF2α，glomerular volume(GV)and glomerular basement membrane thickness(GBM).Results:①compared with group A，group B rats generally in poor condition，FBG，P2hBG，FINS，P2hINS，HOMA-IR，24h-UAlb，U-β2MG，blood and urine 8-iso-PGF2α level indicators have significantly increased，GV increase large and GBM thicken;②compared with group B，group C significantly improved the general situation，each index has improved and increased mitigation in GV and GBM thickeness;③compared with group D，group C significantly improved the general situation，HOMA-IR improved significantly，the other showed no significant difference.Conclusion:8-iso-PGF2αhas correlation with early(QiYin Deficiency)type 2 diabetic nephropathy，Tangshenjian’kidney protective effects of DN rats is achieved by improving the oxidative stress.

8 iso prostaglandin 2α;type 2 diabetic nephropathy;Tangshenjian

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0348-03

湖北省卫生计生委(2013Z-Y36);武汉市2014年“黄鹤英才”(医疗卫生)计划;武汉市卫生局(武卫(2009)76号)程。目前中药对8-iso-PGF2a的影响研究尚少，本研究通过建立DN病证结合模型，探讨8-iso-PGF2a与DN相关性及糖肾煎对其的影响，现报道如下。

2015-07-04

胡爱民(1963-)，男，主任医师，硕士研究生导师，从事内分泌疾病的中医药临床与研究。

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并发症之一。研究表明，氧化应激是 DN发生发展的重要病理生理机制。8-iso-PGF2α是反映体内氧化应激水平的理想指标［1］。也有研究发现，其本身具有生物学活性，并参与DN发生发展过