甲壳类疾病及其防治技术（1）——虾类疾病（一）

○汪建国

（中国科学院水生生物研究所研究员博导）

甲壳类疾病及其防治技术（1）
——虾类疾病（一）

○汪建国

（中国科学院水生生物研究所研究员博导）

（一）病毒性疾病

1.白斑综合征俗称白斑病，是对虾的严重传染性疫病，20世纪90年代以来一直严重威胁着全世界对虾的养殖安全。该病的特点是感染率高、发病急、死亡率高、死亡速度快。病虾活力弱，部分濒死虾头胸甲部位出现白色斑点，白斑综合征因此而得名，但亦可不出现白斑而虾体变红。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为一类动物疫病，OIE将其列为必须申报的疾病。

【病原体】白斑综合征病毒（Whitespot syndromevirus，WSSV）。

【流行与危害】20世纪90年代初，该病首先出现于日本及我国台湾、广东、福建等地，随后扩散并遍及亚洲主要对虾养殖国家和地区。几年后蔓延到南北美洲，造成全球性的对虾养殖业损失。一般虾池发病后2～3天，最多不足1周时间可致全池死亡。

白斑综合征病毒的宿主范围非常广泛。已知40多种对虾和非对虾甲壳动物可感染该病毒，其中中国明对虾最为易感，其他可被感染致病或成为病毒携带者的对虾科生物有：斑节对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾、墨吉对虾、长毛对虾、印度对虾、桃红对虾、细角对虾、白对虾、褐对虾、刀额新对虾等。另外，罗氏沼虾、海南沼虾、埃氏沼虾、蓝氏沼虾、脊尾白虾、鼓虾、克氏原螯虾、哈氏美人虾、龙虾、虾蛄、三疣梭子蟹、锯缘青蟹、中华绒螯蟹、天津厚蟹、肉球近方蟹、日本大眼蟹、鲎等甲壳类动物等也可被感染。

在自然感染过程中，经口和鳃感染是传播的主要途径，对虾在幼体期易经口和鳃感染从而使虾苗携带病毒。此外，发病对虾精巢、精荚、卵巢中都能检测到病毒，因此受精卵可被污染从而造成垂直传播。由于多种甲壳动物都可携带该病毒，自然环境中病毒极易在动物个体间进行传播，使白斑病的防治工作变得较为困难。

【症状及病理变化】发病虾厌食，空胃，行动迟缓，弹跳无力，静卧不动或在水面兜圈。头胸甲易剥离，壳与真皮分离，部分患病对虾在头胸和最后的尾节甲壳内侧可见白色斑点；患病中国明对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾体色发红，而患病斑节对虾在濒临死亡时则显示变蓝现象。血淋巴混浊、不凝固，血淋巴细胞减少。甲壳上白斑的主要成分是碳酸钙，是由于白斑综合征病毒在上皮细胞内的迅速增殖导致钙、磷比显著增高，使甲壳上形成了碳酸钙的沉积。

病毒侵害的主要组织和器官是甲壳下上皮组织、胃及后肠上皮组织、结缔组织、触角腺、造血组织、鳃、血淋巴器官。胃部坏死最严重，肝胰腺实质细胞、中肠上皮细胞、肌纤维细胞不被感染。

感染早期，被侵害组织的少量细胞核略微膨大，核中出现嗜酸性着色区域，核仁边移；随着感染时间延续，细胞核内嗜酸性着色很快转变为大的嗜碱性包涵体，使细胞核显著膨大，染色质只在细胞核边沿隐约可见，大量细胞被侵染。

病毒粒子在细胞核中复制和装配，成熟病毒粒子聚集于细胞核中，最后细胞解体，病毒粒子再感染周围细胞。在肌纤维之间的结缔组织及肝胰腺血窦的血细胞中也可见到病毒粒子。甲壳内面的白点在显微镜下可见呈重瓣的花朵状，外围较透明，花纹较清楚，中部不透明。

【诊断方法】在本病严重暴发流行时，可根据其发病史、临床特征及病理特征作出初步诊断，最后确诊需要通过实验室检查。诊断时应注意与桃拉综合征、细菌性白斑病相区别。本病的实验室诊断方法主要是通过采集急性病例的鳃、胃、附肢或其他上皮组织，进行下列检查。

（1）样品采集采集150尾虾，按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中对虾幼体、仔虾取完整个体，幼虾和成虾取虾的头胸部，非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1～0.5g。

样品采集的要求参照SC/T7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分：压片显微镜检查法）》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。

（2）组织及病理学检查

①新鲜组织的快速染色法：取新鲜的虾组织做成涂片，用“台盼蓝-伊红”染色法（T-E染色法）染色后，检查受感染细胞的典型变化。该方法适用于在现场或诊断实验室对患病濒死的对虾仔虾、幼虾或成虾进行快速诊断。

②组织病理学诊断：经HE染色后可清晰地观察到各种不同组织结构的病理变化。HE染色适用于发病对虾或其他敏感宿主的初步诊断和对怀疑染病宿主的诊断，不适于非感染性携带病毒样品的病毒检测。

③电镜诊断：电镜切片可在病虾鳃、胃、淋巴器官、皮下组织等的细胞核内观察到病毒粒子，通过提纯负染，电镜下可观察到完整的病毒粒子或无囊膜的核衣壳从而进行确诊。

（3）病原学鉴定

①生物诊断法：该法采用白斑综合征病毒指示器-SPF凡纳滨对虾幼虾进行试验。将采集的可疑虾附肢或虾头尖与TN缓冲液混合匀浆，离心上清液用2%无菌生理盐水按1：10的比例稀释，对指示虾进行肌内注射（IM），然后进行临床观察和组织病理学诊断。

②核酸探针检测法：采用白斑综合征病毒特异性的非放射性的地高辛标记探针进行，敏感性高于传统的病理组织学诊断法。核酸探针斑点杂交检测法适用于对虾的成虾、幼虾、仔虾、幼体和受精卵的活体、冰鲜或冰冻产品和其他甲壳动物感染病毒的筛查、临床病症的确诊。

③PCR检测法：通过聚合酶链式反应，检测病毒的特定基因。适用于对虾各种样品、环境生物和饵料生物的各种样品以及其他非生物样品中WSSV的定性检测，具有高灵敏度和高特异性，适用于病原筛查和疾病确诊。

④单克隆抗体检测法：应用特异性的病毒单克隆抗体，采用斑点免疫印迹、免疫荧光和ELISA等方法进行诊断。

【防治方法】

（1）预防选择健康虾作为亲虾，培养健康虾苗。受精卵用含氯漂粉精或碘伏（聚乙烯砒咯烷酮碘）浸洗或用过滤海水并经紫外线消毒后冲洗5分钟。育苗用水应过滤和消毒，育苗期间切忌温度过高和滥用药物。

做好养殖池塘的清淤、消毒及培水工作。虾池在养虾前尽可能彻底清淤，然后进行消毒。用生石灰或含氯消毒剂均匀泼洒全池，消毒后应曝晒1周左右，然后进水。养殖过程中合理用水、培好水色、保持优良水质。在养虾场附近有虾病流行时，停止从海区向蓄水池注水，应将虾池中的水与蓄水池中的水循环使用。养虾池中适当混养一些摄食浮游生物或底栖藻类的鱼或贝类，有利于防止水质过肥，起净化水质的作用。

放养密度要合理。对虾的放养密度应根据当地水源、海域环境、虾池的结构和设备、生产技术、管理经验、虾苗的规格、饲料的质和量等条件而定。饲养管理过程中要注意水质及各种理化因子的变化，保持水体的相对稳定；坚持巡塘，定期检查，正确诊断，积极预防。在养虾池中接种和培养光合细菌净化水质，投喂能提高对虾细胞免疫力的中草药和免疫促进剂，也是目前常用的防治途径之一。

（2）控制对苗种场、良种场实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度。加强疫病监测与检疫、掌握流行病学情况。可通过培育或引进抗病品种、切断传染源以及加强饲养管理等综合措施控制本病。

（3）处理苗种繁殖场内WSSV检疫呈阳性的亲虾和苗种应全部扑杀；病毒阳性的种用和商品养殖虾必须进行无害化处理，禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料使用。

2.桃拉综合征

俗称“红尾病”，是一种严重传染性对虾疾病，急性期以虾体变红（虾红素增多）、软壳，过渡期以角质上皮不规则黑化为特征。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为二类动物疫病。OIE将其列为必须申报的疾病。

【病原体】桃拉综合征病毒（Taura syndromevirus，TSV）。

【流行与危害】该病主要侵害凡纳滨对虾和细角对虾，对虾科滨对虾属所有成员均对本病易感，中国明对虾也对本病易感；凡纳滨对虾除卵、受精卵和虾蚴外，仔虾、幼虾及成虾等各期均对本病易感，主要感染14～40日龄、体重0.05～5g以下的仔虾，部分稚虾或成虾也容易被感染。对虾科其他属成员经直接攻毒也可感染，但一般不表现症状。细角对虾选择系对TSV（基因1型或A抗原型）有抵抗力。

其他已报道TSV的自然感染或试验感染宿主有白对虾、南方对虾、斑节对虾、刀额新对虾、中国明对虾、日本囊对虾、褐对虾和桃红对虾。

目前，本病广泛流行于美洲和东南亚对虾养殖区。该病1992年首次发现于厄瓜多尔桃拉河地区，之后随染疫仔虾和亲虾贸易迅速传播到厄瓜多尔、秘鲁、哥伦比亚、洪都拉斯、危地马拉、萨尔瓦多、巴西、尼加拉瓜、伯利兹、墨西哥、美国等美洲各大虾类养殖区。1999年中国台北从中南美洲进口凡纳滨对虾而传人本病，此后，随亲虾和仔虾的贸易传播到中国大陆、泰国、马来西亚、印度尼西亚等地。

该病发病急，死亡率高。一般发病虾池自发现病虾至对虾拒食人工饲料仅5～7天，10天左右大部分对虾死亡。部分虾池采取积极消毒措施后转为慢性病，逐日死亡，至养成收获时成活率一般不超过20%。本病主要通过健康虾摄食病虾、带病毒水源等方式水平传播；也可经海鸥等海鸟、划蝽科类水生昆虫携带病毒传播。携带病毒亲虾也可能经垂直途径传播到后代，但目前尚无可靠证据。持续感染虾和终生带毒虾是传染源；染疫存活凡纳滨对虾和细角对虾可终生带毒成为疾病传播者。

【症状及病理变化】

（1）症状根据病程和症状，桃拉综合征可分为急性期、过渡（恢复）期和慢性期3个阶段。

①急性期：虾红素增多，虾体全身呈淡红色，尾扇和游泳足呈鲜红色，因此虾民称之为“红尾病”。取尾扇发红的病虾，用10倍放大镜仔细观察细小附肢（如末端尾肢或腹肢）的表皮上皮，可以看到病灶处的上皮坏死。急性感染虾常死于蜕皮期间，处于脱壳后期的病虾以软壳、空腹为特征，濒死虾常浮于水面或池体边缘。

②过渡（恢复）期：介于急性期与慢性期之间，病程极短，以病虾角质层上皮多处出现不规则黑色斑点为特征。在过渡期，典型的急性期表皮损伤在数量和严重程度上都有所减少或降低，病灶坏死处聚集了大量血细胞及其渗出物。大量血细胞随后开始黑化，进而导致病虾角质层上皮呈现不规则的黑色斑点。

③慢性期：成功蜕皮的病虾，从过渡期转入慢性期，一般无明显的临床症状，但对正常的环境应激（如突然降低盐度）明显不如未染疫虾。有的因病毒在淋巴器官持续感染而成为终生带毒者。

（2）病理特征

①急性期：全身角质层上皮、附肢、鳃、后肠、前肠（食管、前后胃室）可见多灶性坏死；有时在角质层皮下结缔组织细胞，以及靠近感染角质层上皮的条纹肌纤维基质也可见感染灶。严重的病例，触角腺管状上皮也遭破坏。多灶性表皮坏死的典型症状包括多个感染细胞聚集在一起、细胞质嗜酸性增加、细胞核固缩或崩解。

②过渡（恢复）期：该期病理特征是桃拉综合征过渡期的典型特征。在HE染色的组织病理切片上，这样的病灶表现为角质层被侵蚀，暴露的表皮血细胞和上皮被大量弧菌感染和侵袭。在桃拉综合征过渡期，对虾淋巴器官的组织切片在HE染色后观察，可能外观正常。但如果应用TSV特异性的cDNA探针对这些切片进行免疫组织化学染色（ISH），就可以观察到大量的病毒聚集在淋巴小管的外周实质细胞内。

③慢性期：该期病虾的组织病理变化不明显，仅可见大量的“类淋巴器官球体”（LOS）。类淋巴器官球体可能与成对淋巴器官的主体相连，或脱离形成异位的类淋巴器官体，位于血腔的局部区域（如心、鳃或皮下结缔组织中等）。类淋巴器官球体由淋巴器官细胞和血淋巴细胞呈球形堆积而成，但从其球形特征以及缺乏中心管（典型的淋巴器官小管），可与正常淋巴器官进行区别。应用TSV特异性的cDNA探针进行免疫组织化学染色，这些“类淋巴器官球体”的部分细胞会呈现阳性反应，而其他靶组织细胞呈阴性反应。

【诊断方法】

（1）初步诊断仅急性期的病虾表现出行为的改变。急性期病虾呈现缺氧状态，常聚集在池塘边缘或水面等溶氧高的地方，从而吸引大量的海鸟捕食。因此由垂死对虾吸引来的海鸟在虾池上空大量聚集，常可代表虾池内暴发了严重的流行病（通常是桃拉综合征或白斑综合征）。通常可以依据流行病学、临床特征和病理特征对急性期桃拉综合征做出初步诊断：病虾虾体全身淡红色、尾扇和游泳足鲜红色，游泳足或尾足边缘处上皮呈灶性坏死，常死于蜕皮期间，表现为软壳、空腹等特征。

（2）样品采集采集病虾10尾，健康虾150尾，按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中，对虾幼体、仔虾取完整个体，幼虾和成虾取虾的头胸部，非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1～0.5g。

样品采集的要求参照SC、T7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分：压片显微镜检查法）》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。

（3）组织和病理学检查依据前述病虾的组织病理特征对该病作出诊断。该方法适用于桃拉综合征的急性期、过渡期和慢性期患病对虾的确诊和对桃拉综合征的筛查，不适用于对潜伏性感染或非感染性携带病毒标本进行疾病诊断。过渡期病虾角质层上皮多处出现不规则黑化斑，血细胞聚集，软壳及虾红素不明显。慢性期一般无明显临床症状。

（4）实验室诊断和病原学鉴定

①生物诊断法：采用SPF凡纳滨对虾幼虾作为桃拉综合征病毒指示器，对疑似感染虾进行生物检测，具体方法有口服法和注射法。口服法：该法比较容易操作，可用较小的SPF凡纳滨对虾幼虾进行试验。指示虾随机分为两组，其中感染组以剁碎的疑似感染虾样品饲喂，对照组以正常饲料饲喂，然后对两组虾进行临床观察和大体病理、组织病理学诊断。注射法：将采集的可疑虾头或全虾样品与TN缓冲液或2%的无菌生理盐水按1：2或1：3混合匀浆，离心取上清作为接种物，对指示虾进行肌内注射，然后进行临床观察和外观症状、组织病理学诊断。注射接种法宜采用较大的指示虾进行。

②免疫检测技术：

斑点酶免疫反应（DBI）：该法以感染虾或SPF虾血淋巴制取纯化病毒，作为检测抗原，点加于MA-HA-N45反应板表面，干燥后，以磷酸盐缓冲液和含山羊血清与酪蛋白的吐温20进行阻断。用单抗TSVMAb1A1进行斑点酶免疫反应。

其他抗体检测方法：包括利用TSV MAb1A1单克隆抗体的间接荧光抗体法（IFAT）和免疫组化法（IHC）等。这些方法适用于组织印片、冰冻切片和脱蜡的固定组织样品及Davidson'sAFA固定的组织样品中的病毒检测。

③分子检测技术：目前已开发有原位杂交实验（ISH）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量逆转录聚合酶链反应（real-timequantitativeRT-PCR）等方法。原位杂交实验是采用非放射性的以地高辛标记的eDNA探针进行，敏感性高于传统的病理组织学诊断方法。逆转录聚合酶链反应法适用于对虾的各生活期、非对虾的生物和底泥等样品中TSV带毒情况的定性检测，以进行病原筛查和疾病的确诊，但该法单独使用时不适用于对病毒量、存在状态（玷污、携带和感染状态）或感染活性等的估测以及宿主感染程度的评估。实时定量逆转录聚合酶链反应法具快速、特异和敏感优点，对TSV基因组目标序列检测灵敏度大约为100个拷贝。

【防治方法】

（1）预防进行水体消毒，每10～15天（特别是在进水、换水后）应及时用漂白粉等含氯消毒剂消毒。调控水质，保持整虾池水质平衡及稳定。虾池pH一般维持在8.0～8.8，氨氮0.5mg/L以下，透明度维持在30～60cm。在养殖过程中，定期使用水质及底质改良剂，改良养殖池底质。特别是在养殖中后期，应用光合细菌、硝化细菌等微生态制剂的改良剂进行水质和底质改良。配合使用维生素、聚维酮碘等进行预防。也可以在饲料中添加生物活性物质或免疫促进剂，增强虾体非特异性免疫功能。

（2）控制可通过培育或引进抗病品种、切断传染源以及加强饲养管理等综合措施控制本病的暴发。对苗种场、良种场应实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度；加强疫病监测与检疫，掌握其流行情况。

（3）处理TSV检疫阳性结果的亲虾和商品养殖虾必须进行无害化处理，禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料使用。

（未完待续）

（通联：430072，中国科学院水生生物研究所武汉市武昌东湖南路7号）