浅谈HA-HI试验的影响因素及其应用

徐艳秋 黄家兴

（腾冲市动物疫病预防控制中心，云南腾冲 679100）

浅谈HA-HI试验的影响因素及其应用

徐艳秋 黄家兴

（腾冲市动物疫病预防控制中心，云南腾冲 679100）

血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI），简称“HA-HI试验”，是目前兽医实验室常用的检测方法，作为血清学诊断技术之一，广泛用于畜牧业生产、动物疫病监测、流行病学调查、动物疫情预警、延伸绩效考核等，但是影响其试验结果的因素很多，对抗原、抗体、红细胞、血清、稀释液、保存液、温度、pH值、作用时间、判定时间、试验器材、试验方法、操作标准等因素，对HA-HI试验的影响进行了概述，以供同类研究和生产应用提供参考。

疫病监测；血凝试验（HA）；血凝抑制试验（HI）；HA-HI试验；影响因素；应用

1 HA-HI试验的特点

1.1 原理

许多病毒的包膜中含有按病毒密码合成的蛋白质（凝集素），这种蛋白质有凝集某些动物红细胞的能力，称为红细胞凝集，简称HA试验。HA试验能被相应的特异性抗体所抑制，阻断病毒颗粒表面上的抗原，病毒与抗体结合形成病毒抗体结合物，加入动物红细胞，产生抑制红细胞凝集现象，称为红细胞凝集抑制试验，简称HI试验。由于这个试验包括HA试验、4单位抗原配制、HI试验三个步骤，准确地讲，应称为HA-HI试验。HA-HI试验，是用于测定血清中的特异性抗体，或用特异性抗体鉴定所分离病毒种属的简单、快速、具有特异性诊断的方法。常用于HA-HI试验检测的动物疫病有禽流感、鸡新城疫、鸡减蛋综合征、兔病毒性出血症、猪犬细小病毒病、流行性乙脑炎、猪流行性感冒、流行性出血热、狂犬病等[1]。

1.2 优点

由于特异性好、能进行大量样本的分析、对试验环境要求不高、节省试剂和易于操作、费用低等优点，主要用于禽流感、新城疫等疫病诊断、免疫状态监测、延伸绩效考核的抗体水平检测、禽流感疫情预警等。

1.3 缺点

HA-HI试验的缺点是：全过程为手工操作，费力费时，与ELISA相比敏感性也低，其检测结果受诸多因素的影响。

2 HA-HI试验的实际应用

2.1 检测抗体水平

（1）我市禽类疫病HA-HI检测现状：详见表1。

表1 腾冲市近年来鸡疫病HA-HI试验抗体检测统计表

（2）用疫苗免疫鸡群后，在正常情况下HI抗体效价保持一定的水平，如用弱毒活疫苗免疫后，HI抗体可达到1：1 6～1：64 （4log2～ 6log 2）；用油剂灭活苗，HI抗体可达到1：256～1：512（8log2～ 9log2），最高可达到1：2 048（11log2）。HI试验作为适时免疫的检测手段，能避免免疫失败的发生。

2.2 疫病诊断

2.2.1 鉴定某些病毒

有些病毒能凝集动物的红细胞，且这种特性被特异性抗血清抑制，也就是说，鸡新城疫的血清只能与鸡新城疫病毒发生血凝抑制现象，而不能与禽流感病毒发生血凝抑制。血清血凝抑制（HI）实验既可用已知抗鸡新城疫病毒的血清来鉴定可疑病毒，又可用已知的新城疫病毒来测定鸡血清中是否含有特异性抗体，以确定鸡群是否感染过新城疫。

2.2.2 辅助诊断某些病毒性疾病

从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，以诊断病毒性传染病，当发现HI抗体异常升高，血凝抑制效价超过11 log2时，说明该鸡群可能感染了鸡新城疫或禽流感，并结合临床症状和剖检变化加以确认。

2.2.3 NDHI与临床症状的关系

NDHI<4 感染100%死亡；NDHI=4-7 感染发病90%不死；NDHI=6-8 感染发病100%不死；NDHI=8-10 感染产蛋下降、NDHI上升；NDHI=11-13 感染只见NDHI上升；NDHI=13-15 病毒无法侵入。

2.3 疫病净化

根据HA-HI试验的抗体检测和疫病诊断的特性，可用于养鸡场的禽流感、鸡新城疫的监测净化。

2.4 跟踪监测

养禽场在疫病发生时或是在疫苗免疫后应做抗体的跟踪监测。在每次疫苗接种后可随机抽10%的样本进行抗体监测，以确定本次免疫的成功情况，决定是否进行补免甚至重免。

2.5 评价高免血清

HA-HI试验可测定新城疫或禽流感等高免血清及卵黄抗体的效价，对其进行质量评价。当抗体水平在9 log2以上时，可作紧急预防或早期用生物药品治疗。

3 HA-HI试验的影响因素

3.1 抗原

3.1.1 选择进购与疫苗毒株一致的诊断试剂。合理选择抗原，免疫监测实质上是一个抗原抗体反应的过程。疫苗种毒株与抗原所用毒株相同，测得的HI效价就高。在血凝抑制试验操作时，挑选亲和型毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度，也就是说如使用某一厂家的疫苗，最好用此厂家提供的抗原做检测。

3.1.2 配制合适浓度的四单位抗原。按照农业部的标准检测方法，检测用的抗原稀释为四个单位后还需做一次回归实验，即检测四个单位的抗原是否准确，但是生产中这一步经常被省略。事实上随着抗原浓度的增加，HI滴度逐渐下降，每增加1倍浓度，滴度下降0.9～1.1log2。

3.2 抗体与血清

血清要求不腐败、不变质的、合适采样时间的标准样本。在采样的过程中盛放样本的试管不能污染，不能含有杂质，不能含有与抗体无关的蛋白质，也不能加抗凝剂，不能有溶血物，否则血清就不易分离或影响其抗体的效价。被检血清必须新鲜，血样采集后，应及时分离血清，分离好的血清应该是淡黄色、透明液体。分离后应及时测定或放置4℃冰箱内保存，保存时间不宜过长，要力求新鲜，否则影响检测效果。

3.3 红细胞

3.3.1 红细胞来源：如果红细胞来源于同一只鸡，则可能产生自凝现象。因此应选择3～4只健康鸡的血液混合后制成红细胞悬液，以减少自凝现象的干扰。这些健康鸡最好是SPF级成年公鸡。

3.3.2 红细胞浓度：在生产中常用0.5～1%的红细胞。不同浓度的红细胞对HI效价有一定的影响，浓度大时HI值相对较小，浓度小时HI值相对较高。当浓度为1%，沉降的血点过大；浓度为0.5%，沉降的血点太小，不易判断，沉降速度太慢。我兽医实验室常用1%的红细胞。

3.3.3 红细胞制备：为保证1%红细胞的稳定性和浓度的准确性，离心时要掌握离心速度和离心时间，同时固定洗涤液。洗涤时要尽量除去表面的白细胞膜，洗涤次数不宜过多，肉眼观察上清液澄清透明即可。1%红细胞应保存于4℃，且不超过2d。新鲜红细胞质脆易碎，不易保存，应随配随用。

3.3.4 红细胞醛化：醛化红细胞性质稳定，在蒸馏水中不溶血，不易腐败，可在4℃条件下保存数月至1年。使用方便，反应均一、稳定，图像清晰，结果一致和易判定等优点。而醛化红细胞的检测结果比新鲜红细胞低1～2效价。

3.4 稀释液与pH值

3.4.1 阿氏液蒸馏水和阿氏液配制是否正确，影响到1%红细胞的配制，干扰试验结果。

3.4.2 稀释液在血凝试验中，最常用稀释液pH值为7.0～7.2的PBS缓冲液，PBS液的pH在5.8以下，红细胞易发生自凝；pH值在7.2时，红细胞沉降最充分，图形最清晰，HA值最小，HI值最大。pH值在7.8以上时， 图形洗脱加快，易造成观察误差。PBS液要现配现用， 配制好必须用NaoH或HCL调pH值至7.2，如果用生理盐水代替PBS液，要使用新开瓶的灭菌生理盐水; 稀释液的配制时间不易过长，否则可能被环境污染，因不能保持无菌的反应环境，而使得检测结果受到干扰，出现试验不成立、跳孔等现象。

pH7.0～7.2PBS缓冲液测定抗原的血凝滴度比常用0.85%生理盐水和调pH至PH7.0～7.2生理盐水高出将近一倍，测定的阳性血清的抗体滴度高出一孔。试验表明用PBS为稀释液能够降低试剂成本、提高检出率，以PBS缓冲液的测定值最高。

3.4.3 pH值：采用PBS作稀释液，pH<5.8时红细胞易自凝，pH>7.8时凝集的红细胞解凝加快，pH为7.0时红细胞沉淀最充分，图形最清晰。采用生理盐水作稀释液，pH<6.5或>7.4时，红细胞发生溶血现象，pH为7.0时不发生溶血。因此，最佳的pH值为6.5～7.4，通常用pH值为7.0～7.2的稀释液，最适宜鸡红细胞，效价高，且图形清晰。

3.5 试验器材

3.5.1 微量血凝板目前，县级实验室多使用有机玻璃材料的96孔凝集板，其清洁度对试验结果有很大的影响。一般来说：试验完毕后，应立即用清水反复冲洗，再用含有洗涤剂的温水溶液浸泡30min，并在洗涤剂溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，待反应板干燥后，放到浓度为2～3%的盐酸溶液中浸泡24h以上，取出后用清水冲洗多次，最后以蒸馏水冲洗2～3次，在37℃温箱中烘干备用。使用前检查血凝板，将其正对日光灯，孔底光洁、透明、无可见沉淀附着物为准。因微量反应板V型孔内壁应光滑，不能用试管刷等来刷洗V型孔，不洁净的反应板会造成红细胞的非特异性凝集，影响结果的判定， 现在多数使用一次性凝集板，这必须保持板面及凹孔的干净及平整。

3.5.2 移液器在稀释血清时，产生气泡，造成移液量减少。在使用微量移液器时，吸头要安装牢固，防止漏气，操作时移液吸头应插到液面以下，手压下的力度要均匀，否则移液量不准，造成结果偏差。在使用多道移液器时，吸取液体后观察几个吸头中液面是否水平一致，有时操作不注意可能引起某个吸头吸入量或多或少，直接影响结果测定。吸取的过程应该做到“慢吸快打”，在吸液时要慢、准，放液时对准孔后速度要快，可以避免打完后吸头下存留液体，保证加入的液体体积一致。倍比稀释血清时，在吸取第一孔时要先按下移液器，再插入反应板孔内，吸取后插入第二孔液面下，在反复抽取过程中，移液器吸头不要离开液面，以防止产生气泡，造成移液量不准。

3.5.3 吸头加液体时，吸头与反应板孔接触造成样品交叉。尤其是在最后加入红细胞悬液时，孔内已有稀释液、血清、抗原等，如果吸头接触到孔内混合液，会造成各个孔内液体相互交叉，导致试验结果出现误差，所以在使用移液器时，一定要保持加样器吸头与凝集板孔间的距离，以保证每个凝集孔内液体量和浓度准确。

3.5.4 振荡器振荡器工作平稳、匀速，无异常震动、抖动。否则混合液浓度不准[6]。

3.5.5 恒温箱恒温箱温度能精确保持设定温度，以保证试验所需温度。

3.6 操作、试验方法与判定方法

3.6.1 操作人与人之间的操作存在一定的偏差，造成人为干扰。因此，要严格按《高致病性禽流感诊断技术》GB/T18936-2003、《鸡新城疫检测技术规范》GB/T16550-1996国家标准和抗原使用说明书进行试验操作。

3.6.2 试验方法全量法和β-微量法的原理是一致的。全量法误差小，但操作慢、耗抗原及器材多。微量法节省抗原、测样多。在全量法和微量法中以生理盐水为稀释液，以1%红细胞悬液作反应指示剂和完全凝集抑制为判定终点的方法较好。全量法测得的HI效价较微量法约高0.5～1个效价，其灵敏度和准确度较高[2][3]。我兽医实验室常用β-微量法。

3.6.3 判断方法不同的人在判断75%、50%、25%的凝集或凝集抑制时，判断结果差异较大，而对100%的凝集或凝集抑制基本上无差异。实际应用时一般以100%抑制为判断终点。

4 结论

HA-HI试验，应用广泛，是目前兽医实验室常用的血清学检测方法。HA-HI试验的影响因素有很多，在进行试验前应综合考虑各方面的影响因素，选定一个适合自身实验室条件的试验标准，操作细心、标准，以降低试验误差。

[1] 毕云龙，李松柏主编.实用兽医血清学诊断技术[M].云南省兽医防疫总站，1994.

[2] 农业部制定.动物防疫标准汇编[M].中国标准出版社，2004.

[3] 李金福，金卫华主编.动物疫病监测与控制[M].云南科技出版社，2000.