自精保存在辅助生殖技术中的临床效果分析

陈碧?马天仲?宋丽君?荆霞?张云山

【摘要】 目的 探讨自身精子冷冻保存（自精保存）在辅助生殖技术中的意义。方法 ①对进行自精冻存的73例患者的临床资料进行回顾性分析， 包括精子冻存原因、冻存精子使用率、复苏成功率等。②另选同期在本中心接受自精保存作为体外受精（IVF）治疗周期患者314例（A组）， 以及夫精人工授精（AIH）术前未行任何干预患者341例（B组）， 观察两组取精困难发生率及手术取消率。结果 ①梗阻性无精子症是自精冷冻的最常见原因， 而且使用率也最高， 为57.9%；其次是严重少弱精子症及取精困难者。但取精困难及严重少弱精子症患者的冻精使用率均较低， 分别为16.7%及6.7%。精子复苏成功率均>90%， 仅2例梗阻性无精子症患者精子复苏后无足够可用精子而再次穿刺取新鲜精子。②A组患者采卵日发生取精困难者2例， 发生率0.64%， 手术取消率为0；B组患者手术日发生取精困难者8例， 发生率2.35%， 手术取消率为1.17%。结论 自身精子冷冻保存在辅助生殖技术中有重要意义， 特别是在避免梗阻性无精子症患者遭受不必要的反复侵入性操作及降低因男性取精困难造成的辅助生殖治疗周期取消率方面有重要意义。

【关键词】 精子；低温保存；辅助生殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.08.007

Analysis of clinical effect by autologous sperm preservation in assisted reproductive technology CHEN Bi， MA Tian-zhong， SONG Li-jun， et al. Reproduction Center， Affiliated Hospital of Guangdong Medical College， Zhanjiang 524001， China

【Abstract】 Objective To investigate significance of autologous sperm cryopreservation in assisted reproductive technology. Methods ① A retrospective analysis was made on clinical data of 73 patients receiving autologous sperm cryopreservation， including their reasons for autologous sperm cryopreservation， usage rate of cryopreserved sperm， and successful recovery rate. ② There were 314 patients receiving autologous sperm cryopreservation as in-vitro fertilization （IVF） treatment （group A） and 341 patients receiving artificial insemination by husband （AIH） without any preoperative intervention （group B）. Their incidences of semen retrieval difficulty and operation cancellation rates were observed. Results ① As the most common reason in autologous sperm cryopreservation， obstructive azoospermia had the highest usage rate as 57.9%， followed by severe oligoasthenozoospermia and semen retrieval difficulty. However， the usage rates in oligoasthenozoospermia and semen retrieval difficulty were as low as 16.7% and 6.7%. The successful recovery rates in patients were all > 90%， and there were only 2 cases with obstructive azoospermia received puncture semen retrieval. ② There were 2 cases with semen retrieval difficulty in group A， with incidence as 0.64% and operation cancellation rate as 0. There were 8 cases with semen retrieval difficulty in group B， with incidence as 2.35% and operation cancellation rate as 1.17%. Conclusion Autologous sperm cryopreservation shows important significance in assisted reproductive technology， especially for avoiding unnecessary repeated invasive operation in obstructive azoospermia patients and reducing assisted reproductive technology treatment cancellation rate due to semen retrieval difficulty.

【Key words】 Sperm； Cryopreservation； Assisted reproductive technology

随着人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology， ART）的发展， 单精子卵胞浆内注射（intracytoplasmic single sperm injection， ICSI）已渐趋成熟， 理论上只要有一条活动精子， 就能使成熟卵子受精， 使患者受孕。而精子冷冻技术日益成熟， 特别是极少量精子冷冻技术的发展， 使患者因各种因素需要冷冻自身精子用于后续ART治疗成为可能。部分男性患者在妻子取卵日由于精神紧张无法取出精液， 导致需行穿刺术取精或冷冻卵子；部分严重少弱精及隐匿精子症患者取卵日无可用精子；梗阻性无精症患者在门诊穿刺检查时有精子， 但取卵日附睾或睾丸穿刺取精时却找不到可用精子， 患者除了需忍受两次穿刺的手术创伤， 还要承受卵子冷冻或取消周期的治疗费用的增加；有些患者因自身职业关系， 如海员或执行任务的军人在取卵日无法到场。因为这些种种因素， 患者要求冷冻自身精子。在2013年4月～2015年4月， 本中心对行辅助生殖技术前因各种因素需行精液冷冻保存的部分患者行自精保存。本文对本中心患者进行回顾性分析， 探讨自精保存在辅助生殖技术中的临床意义， 以及在行人类辅助生殖技术过程中男方取精困难的预防措施， 从而确保助孕顺利进行。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2013年4月～2015年4月在广东医学院附属医院生殖中心行自体精子冻存的男性患者73例。另选同期在本中心接受IVF患者314例（A组）， 其中12例（3.8%）在进入治疗周期前表现有明显取精困难倾向的患者接受主动干预治疗；AIH术前未行任何干预的患者341例（B组）， 其中6例（1.8%）手术日突发取精困难的患者接受被动干预治疗。精液标本分为射出精子及穿刺精子两种。射出精子来源于患者手淫或用专用取精套同房取精。精液冻存前需做精液常规分析（参照世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册第5版）， 包括精液量、精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率及存活率等；所有患者均进行染色体检查及传染病筛查。

1. 2 方法

1. 2. 1 标本收集 手淫取精患者禁欲2～7 d， 取精前排尿， 清洁会阴， 手淫法完整采集。标本采集在本中心指定的取精室进行。手淫取精困难者， 可采用特制的避孕套同房进行精液采集。精液需收集到一次性无菌无毒的专用取精杯内。附睾或睾丸穿刺取精者常规消毒铺巾， 用7号头皮针穿刺附睾或睾丸， 附睾液加入装有1 ml精子洗涤培养基（美国Quinns）的培养皿中；睾丸穿刺取精需在解剖镜下用1 ml注射器针头撕碎曲细精管， 再置于倒置显微镜下观察有无精子。

1. 2. 2 精子冷冻 逐滴把1份精子冷冻培养基（Quinns AdvantageTM Sperm Freezing Medium）加进1份液化好的精液样本。每滴培养基加入时， 要不断混合以确保精子细胞与冷冻培养基能彻底平衡。混合后孵育10 min。标记冷冻用的精液贮存管（包括患者姓名和日期）， 分装孵育过的精液到冷冻管， 每份约1～2 ml， 盖紧。将冷冻管平放在离液氮面10～20 cm高度20～30 min， 把冷冻管放在铝架上， 然后移至液氮罐保存。

1. 2. 3 精子解冻 找出需要解冻的精液标本， 双人核对确认后， 把冷冻管取出， 35℃水浴直至完全溶解。把解冻后的精子溶液倒进试管， 一滴一滴缓慢地在30 s内把3份精子冲洗培养基与精子溶液彻底混合以确保精子冷冻培养基已被稀释。根据解冻后的精子质量采用相应精液优选方法获有活力精子。附睾或睾丸穿刺取精者如果未找到活动精子或活动精子过少， 则重新睾丸或附睾穿刺取精；手淫取精者当天先留取新鲜精液， 如无法取出精液或当天精液中未找到活动精子或活动精子过少， 则复苏精液。

2 结果

2. 1 自2013年4月～2015年4月， 73例男性患者在广东医学院附属医院生殖中心行自体精子冻存。精液冻存原因分布、冷冻前精液质量、使用率、复苏成功率见表1。梗阻性无精子症是自精冷冻的最常见原因， 而且使用率也最高， 为57.9%；其次是严重少弱精子症（15例）， 由于担心女方取卵日无法取到足够可用精子而要求冷冻精液；12例取精困难患者因担心取卵日无精子可用又不愿意选择冻卵或穿刺术取精要求冻精。但取精困难及严重少弱精子症患者的冻精使用率均较低， 分别为16.7%及6.7%。73例患者的精子复苏成功率均>90%， 仅2例梗阻性无精子症患者精子复苏后无足够可用精子而再次穿刺取新鲜精子。

2. 2 自精保存对取精困难患者的效果评估 A组314例IVF患者采卵日发生取精困难者2例， 发生率0.64%（2/314）， 需解冻冻存精子， 手术取消率为0。B组341例AIH患者手术日发生取精困难者8例， 发生率2.35%（8/341）， 患者接受被动干预治疗， 仍有4例未能成功取精而取消人工授精， 手术取消率为1.17%。

3 讨论

随着ICSI技术的发展， ICSI技术已作为常规技术应用于辅助生殖临床治疗， 给越来越多的不孕症患者带来福音。而精液冷冻结合ICSI技术更进一步拓宽了不孕不育的治疗范围。精子的质量及来源不影响ICSI治疗的受精及早期妊娠结局[1]。目前对小鼠冷冻精子的胚胎发育和表观遗传学的研究发现， 与新鲜精子组相比， 冷冻精子的胚胎的表观遗传重组动态进程并没有改变[2]。目前精子冷冻方法主要有慢速冷冻和玻璃化冷冻， 两种冷冻方法之间精子活动率下降及DNA损伤无显著差异[3]。但是常规精子冷冻方案却不适用于稀少精子冷冻， 解决稀少精子冷冻技术将在很大程度上改善临床治疗少、弱精子症和无精子症患者的不育问题。寻找合适冷冻载体是目前稀少精子冷冻的研究重点之一。目前稀少精子不同载体冷冻方法有：空卵膜载体冷冻法、微滴冷冻法及其他微型载体冷冻法[4]。在国内一些人类精子库已开展肿瘤患者的精液冻存[5]， 拓宽了不孕不育的治疗范围， 给越来越多不孕症患者带来福音。

在本院行自精保存的患者中， 梗阻性无精子症是自精冷冻的最常见原因， 而且使用率也最高， 与张静雯等[6]报道一致。与自精保存避免了梗阻性无精症患者在门诊穿刺检查时有精子， 但取卵日附睾或睾丸穿刺取精时却找不到可用精子。患者不需忍受两次穿刺的手术创伤， 以及因卵子冷冻或取消周期而导致治疗费用的增加， 减轻了患者经济负担。但因附睾或睾丸穿刺取出的精子量较少， 目前极少量精子的冷冻技术仍处于研究阶段， 在临床上尚未能常规应用。目前仍使用传统的慢速冷冻方法， 考虑到慢速冷冻法中精子的复苏存活率<50%， 因此要求活动精子的数量要≥10条， 才能保证复苏后有足够的精子用于ICSI。

部分男性患者在妻子取卵日由于精神紧张无法取出精液， 导致需行穿刺术取精或冷冻卵子。为确保助孕顺利进行， 在妻子进入助孕周期后， 丈夫取精行精液冻存有助于消除患者紧张及不安情绪。采取主动干预措施使取精困难发生率极低， 而且万一患者手术日无法取出精液， 仍可冷冻精子可用。自精保存对缩短该类患者的助孕周期， 减少助孕费用有积极意义。

总之， 自精保存在行人类辅助生殖技术过程中作为男方取精困难的主动干预措施是有效的， 可确保助孕顺利进行。

参考文献

[1] 刘倩， 吴莲芝， 谢青贞. 不同精子参数及来源与ICSI结局的相关性研究. 现代妇产科进展， 2013， 22（8）：651-653.

[2] 巢时斌， 李建春， 金萱， 等.小鼠冷冻精子的胚胎发育和表观遗传学.中国科学：生命科学， 2012， 23（5）：374-382.

[3] 张静静， 章志国， 贺小进， 等.玻璃化冷冻与慢速冷冻对微量精子活动力和DNA完整性的影响.安徽医学， 2013， 34（5）：533-536.

[4] 陈春华， 沙艳伟， 李萍. 稀少精子冷冻研究进展.中华男科学杂志， 2013， 23（8）：63-69.

[5] 平萍， 朱晓斌， 刘勇， 等. 上海地区男性生殖保险6年回顾性分析. 中国男科学杂志， 2009， 23（8）：41-44.

[6] 张静雯， 马文敏， 赵军， 等. 自精保存在辅助生殖技术中的应用和意义.中国妇幼保健， 2014， 29（12）：1885-1888.

[收稿日期：2015-11-03]