动物源性食品中头孢菌素类药物残留检测方法研究进展

洪云鹤,李伟青,林　中,3,张　元,张经华,刘　艳,张宝善,张　峰,*

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100176;2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;3.莆田出入境检验检疫局综合技术服务中心,福建莆田 351100;4.北京市理化分析测试中心,北京市食品安全分析测试工程技术研究中心,北京 100089)



动物源性食品中头孢菌素类药物残留检测方法研究进展

洪云鹤1,2,李伟青1,林中1,3,张元1,张经华4,刘艳4,张宝善2,张峰1,*

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100176;2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;3.莆田出入境检验检疫局综合技术服务中心,福建莆田 351100;4.北京市理化分析测试中心,北京市食品安全分析测试工程技术研究中心,北京 100089)

由动物养殖过程中抗生素滥用而引发的食品安全问题已经引起社会各界的广泛关注。当前已有5代近60种头孢菌素类抗生素被应用于人用药和兽药领域,为全面了解动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留检测现状,本文总结了动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留检测相关技术的应用情况,详细介绍了样品前处理及检测方法研究进展,并对食品中该类抗生素残留检测技术发展前景予以展望。

头孢菌素,动物源性食品,检测,药物残留

头孢菌素(Cephalosporins)类抗生素是一类具有β-内酰胺环的广谱半合成抗生素。意大利微生物学家Brotzu[1]于上世纪50年代在城市下水道入海口的海水中发现了对金黄色葡萄球菌和伤寒杆菌有抗菌作用的霉菌,并鉴定为头孢菌属(Cephalosporiumacremonium)。研究学者从其发酵液中先后分离出了七种具有抗菌作用的物质,统称为头孢菌素[2]。发展至今已有5代近60种该类抗生素被成功研制出来,对于革兰氏阳性菌、阴性菌及螺旋体均显示广谱抗菌活性。头孢菌素具有杀菌力强、毒副作用小、过敏反应少、且对于酸和β-内酰胺酶比青霉素稳定等优点,被广泛应用于临床和兽药领域[3]。然而,头孢菌素的不规范使用会导致在动物体内残留蓄积,长期食用含该类药物残留的动物源性食品会增加人类感染抗药性细菌的风险,且对于对该类抗生素有过敏反应的人群而言存在极大的健康威胁。出于这些不利因素的考虑,欧盟、美国、日本等都对于奶类、肉类和动物内脏中头孢菌素残留制定了限量标准,我国农业部规定牛奶中头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋等该类药物最高残留限量(MRL)4～100 μg/kg,肌肉、肝脏、肾脏中限量为50～1000 μg/kg[4]。随着人们对食品安全问题的重视,各国的限量标准也更加严格。因此,对于头孢菌素类抗生素检测技术的研究尤为重要。

当前对于动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留的检测主要集中在奶类、蛋类、肉类、鱼等水产品中,为满足动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留相关研究需要,近年来各国技术人员在该领域的研究都取得了较大的进展,开发出微生物分析法、免疫分析法(IAS)、液相色谱法(LC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、毛细管电泳法等多种该类抗生素检测技术,研究论文报道日益增多,为该类兽药的合理使用、动物源性食品的质量安全等提供了一定的技术支持。但目前还少有头孢菌素类抗生素残留检测技术相关综述报道,本文针对当前动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留研究现状及其检测技术进行综述,以期为该领域的研究和监控提供依据和参考。

1　 样品分析前处理技术

动物源性食品普遍含有较高的蛋白质、脂肪、糖类、无机盐、维生素等组分,这就要求在前处理阶段尽可能多地提取待测物质同时,排除这些内源性物质的干扰,降低检测限[5]。目前用于动物源性食品头孢菌素残留检测的前处理方法主要有液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、基质固相分散萃取(MSPD)、磁性固相萃取(MSPE)及QuEChERS法等[5-7]。

1.1 液-液萃取(LLE)

液-液萃取是利用两种不相溶的液相之间物化性质的差异来进行物质的差别分配,从而使溶剂从一相转移到另一相[8],也可以通过对pH的调节改变物质在两相中的分配,具有分离效率高,容易操作等优势,但同时也存在方法繁琐、选择性差、操作时间长、有机废液多的缺点。Marilena E.Dasenaki等[9]应用液-液萃取前处理方法,建立了牛奶和鱼类中包括头孢匹林、头孢克洛等头孢菌素类药物在内的143种药物残留的Q-TOF(四级杆-飞行时间串联质谱)筛查方法,向样品中加入含0.1%甲酸和0.1% EDTA(乙二胺四乙酸)的水、甲醇及乙腈,涡旋混匀使用超声提取,离心后上清液放于-20 ℃ 12 h以除去蛋白质和部分脂质,最后加入正己烷脱脂完成净化。Joseph M.Storeya[10]等建立了水产品中七类抗生素残留的LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱)检测技术,样品中加入EDTA-Mcllvaine(乙二胺四乙酸-磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液)后,使用乙腈、对氨基苯磺酸、氯化钠等作为提取剂,振摇提取,取有机层检测,得到88%～118%的回收率,检出限0.073～0.915 μg/kg。

近年来,还有学者将传统液-液萃取技术与固相萃取技术相结合,于样品SPE上柱前先使用LLE对复杂样品基质进行初步净化提取,再使用SPE的高选择性对样品进一步富集净化,有效地减弱具有复杂成分样品中的基质效应[11]。但液-液萃取技术普遍存在试剂消耗量大、净化溶液组成复杂、操作费时等缺陷,在动物源性食品中头孢菌素类药物残留检测中已经逐步被其他前处理方法所取代。

1.2固相萃取

较为常见的SPE固相萃取技术是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,与样品中的干扰化合物分离然后再用洗脱液洗脱,从而达到分离富集目标化合物的目的[12]。在动物源性食品中兽药残留的检测过程中,常将固相萃取作为色谱、质谱等检测手段的前处理技术以减少样品中的基质效应,因其操作简单、方便快捷、重现性好、应用范围广等优点,在现代检测技术中被广泛使用。Noemí Dorival-García等[13]建立了牛奶中38种抗生素残留的检测技术,样品加水和乙腈提取,氮吹后加入PBS溶液(磷酸盐缓冲液),采用HLB固相萃取柱净化样品,以1∶1的乙腈-水溶液洗脱,经UPLC-MS/MS(超高效液相色谱-串联质谱)检测,该法回收率为68%～118%,定量限0.03～10 μg/kg。

美国的Barker教授[14]于1989年在SPE前处理技术基础上提出了一种快速样品前处理技术,即基质固相分散萃取(MSPD)。该法将待测样品与适量分散剂即吸附剂混合研磨均匀,转移至层析柱中,采用适当的有机溶剂进行洗脱,分散剂加大了洗脱溶剂与待测样品的接触面积,从而达到了快速分离溶解待测物质的目的。Eftichia G等[15]建立了超声辅助基质固相分散萃取的HPLC-DAD检测技术,对于牛奶中8种头孢菌素类抗生素做以筛查,使用Nexus材料作为吸附剂,方法精密度(RSD)均低于15.3%,样品检测中8种头孢菌素回收率稳定在93.8%～115.3%之间,LOQ为5.0～48.3 μg/kg。

磁性固相萃取是近几年发展起来的一种用于复杂基质中分离痕量目标物的热点技术,目前已经用于食品安全检测领域。该法是在处理过的磁铁矿等磁性颗粒表面,修饰上用于吸附待测物质的官能团材料,以实现对目标物质的富集净化,具有操作简单、萃取时间短、有机溶剂用量少、分离速度快等优势,较之其他样品前处理技术手段更高效快捷,具有良好的发展潜力。Xiaodan Liu等[16]将C-18 Fe3O4@mSiO2磁性微球(C18修饰的磁芯孔壳微球)用于牛奶中头孢菌素的检测前处理,样品中加入微球吸附待测物质(3种头孢类抗生素),再装柱净化洗脱,采用LC-MS/MS法分离检测,方法回收率85%～115%,精密度(RSD)6.3%～10.8%。

固相萃取技术因其选择性高、重现性好、操作简便、净化效果好等优势,成为动物源性食品中头孢菌素类药物残留分析时的首选前处理技术。

1.3QuEChERS法

所谓QuEChERS法即快速(Quick)、简易(Easy)、便宜(Cheap)、有效(Effective)、稳定(Rugged)、安全(Safe)的前处理方法。一般来说是采用乙腈或醋酸乙腈为提取剂,以氯化钠和无水硫酸镁等盐类为吸水剂,PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)去除糖和脂肪、色素等杂质干扰[17]。该法也因其独特的性能和快速、简易、费用低廉、适用范围广等优点在残留分析中被广泛应用。

近年来研究学者又在原方法基础上做以改进开发出适用于多种兽药残留检测的QuEChERS法。为头孢菌素类药物残留检测的QuEChERS净化技术提供了充足的先行条件。George Stubbings[18]开发出使用QuEChERS技术检测肌肉组织中多种兽药残留的LC-MS/MS法,取样品匀浆5 g加入1%乙腈-乙酸溶液(V:V)15 mL溶解,添加5 g无水硫酸钠涡旋混匀,离心取上清液添加Bondesil NH2吸附剂15 min后离心,取上清液3 mL氮吹浓缩再采用1∶1的乙腈-水溶液复溶,该法平均回收率为79.8%,检出限可达3 μg/kg。卜明楠等[19]建立了虾肉中72种兽药残留的QuEChERS 结合液相色谱串联质谱测定的分析方法,使用5%的醋酸乙腈溶液作为提取剂,配合无水硫酸钠和氯化钠均质提取离心,上清液添加C18分散剂,乙腈为提取剂,氮吹浓缩,1%甲酸-乙腈(4∶1)溶液定容,方法准确性和重复性良好。

由于头孢菌素类药物侧链基团结构复杂多样,检测技术开发较为困难,在现已经开发出的动物源性食品中药物残留QuEChERS前处理方法中,只涉及很少一部分该类药物残留检测技术;但QuEChERS技术具有机试剂消耗量少,环境污染小,操作简单的优势,在动物源性食品中头孢类药物残留检测前处理技术的应用上具有很大的发展空间。

1.4其它样品前处理方法

除上述样品前处理方法外,近年来还有学者逐步将超临界流体萃取、微波萃取、分子印迹等技术应用到动物源性食品中抗生素残留的检测方面[20-22]。

但在现有技术水平下,超临界流体萃取(SFE)对于部分食品基质中抗生素萃取率相对偏低,选择性不高;分子印迹技术操作复杂,对环境要求高;微波萃取存在萃取溶剂挥发、可能改变部分待测物质结构等目前尚未得到解决的不利因素,在动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留检测领域尚未得到广泛使用。

2　检测方法

目前来说,应用于食品中头孢菌素类抗生素残留检测方法大致可分为微生物分析法、免疫分析法和仪器分析法三类。

2.1微生物分析法

微生物检测法主要是根据抗生素对特异微生物的生理机能、繁殖代谢的抑制作用,对抗生素残留进行定性、定量检测,以此来确定基质中该类抗生素残留量。李延华等[23]应用常见的BSDA法(嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法)、TTC法[24](氯化三苯基四氮唑法)和试管扩散法三种微生物检测法对牛奶中包括头孢吡林在内的6种β-内酰胺类抗生素残留进行检测。以欧盟法典中最大残留限量为标准,其中BSDA法检测限可达0.50倍MRLs,但检测时间较长,操作繁琐;TTC法对于实验中的6种抗生素检测限为2～6倍的最大残留限量,不符合标准;而试管扩散法检测限为0.5～1.5倍MRLs,且较之其他两种检测法在检测时间和操作难易程度上而言具有一定的优越性。

但食品基质组分复杂,微生物检测法在实际应用中,特异性不强,易受到其他具备抑菌作用的抗生素残留及其他物质干扰,出现假阳性结果,因此很难实现标准化定量检测。

2.2免疫分析法(IAS)

免疫分析法是以抗原抗体识别为核心反应的分析方法,具有单独任何一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度,适用于复杂基质中痕量组分的分离检测,但其中抗体制备技术复杂且不容易实现高通量,目前用于药物残留分析的免疫分析法主要包括放射免疫分析法和酶联免疫检测法[25]。

放射免疫检测法在抗生素类残留分析检测中的应用包含CHARMⅠ和CHARMⅡ法[26],其中CHARMⅠ是专用于牛奶中头孢菌素等β-内酰胺类抗生素残留的检测方法,而CHARMⅡ法还可用于其他食品基质中多种抗生素残留的快速检测[27]。中国采用CHARMⅡ试剂盒制定了相关出入境检验检疫标准,用于检测动物源性食品中包括头孢菌素在内的多种抗生素残留。

酶联免疫检测法(ELISA)[28]是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使得酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,酶与底物产生的颜色反应即可用于待测物质定量测定。姜侃等[29]应用酶联免疫检测法建立了乳品中β-内酰胺类抗生素残留的快速检测方法,方法特异性强,操作简便,检测限达1.1～2.4 μg/L。

酶标记受体分析法(ELR)的应用上,李铁柱[30]建立了酶标受体方法检测牛奶中的头孢噻呋和青霉素G,检测限可达20 μg/kg。美国IDEXX公司[31]以免疫受体为原理研发了Parallux实验室仪器,实现了使用该法检测多种抗生素及其他干扰发酵的物质,已被美国FDA批准用于头孢类残留的检测。

应用于抗生素残留检测方面的免疫分析法还包括胶体金免疫层析法[32],王学力等[33]建立了同步检测头孢菌素类抗生素与链霉素胶体金免疫层析法,在不同基质中对于头孢氨苄、头孢拉定的最低检测限为20～100 ng/mL。此外,还有荧光免疫分析法、免疫亲和层析等技术应用于抗生素的检测中。

2.3仪器分析法

近年来,仪器分析技术以其方便、快捷、准确的特点在动物源性食品抗生素残留检测方面被广泛应用,具有高灵敏度、低检测限、低定量限、重现性好等优势[34]。目前已经被开发的头孢菌素类兽药残留仪器分析检测方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、超高效液相色谱法(UPLC)、毛细管电泳法(CE)等。

2.3.1液相色谱法(HPLC)液相色谱法是最早用于检测动物源性食品中头孢菌素残留的方法之一,具有分离效率高、灵敏度高、适用范围广等优点,在食品分析领域备受关注。食品基质组分较为复杂,色谱技术的应用可以通过对流动相和固定向的选择,将复杂组分中的待测物质和干扰成分加以分离,并采用光谱或质谱检测器对待测组分进行分析鉴定。

传统HPLC技术常配置紫外或荧光等光学检测器,头孢菌素类抗生素拥有良好的紫外吸收,因此在食品中该类抗生素残留的分析中常使用DAD检测器。Lambert K.Sørensen等[35]人使用该技术建立了牛奶中4中头孢菌素类残留的检测方法,样品离心脱脂,乙腈沉淀蛋白后取上清液氮吹浓缩至2 mL,加水定容到20 mL,使用tC18 SPE固相萃取柱净化样品,设置甲醇-乙腈水溶液梯度洗脱程序,四种头孢菌素类抗生素检测限7～11 μg/kg,在20～200 μg/kg浓度范围内线性和回收率良好。

超高效液相色谱(UPLC)是在HPLC系统基础上开发出的使色谱分离解析度更高层次的一种分离检测技术,与传统HPLC技术相比,UPLC具有更小的延迟体积和更高的检测器灵敏度,因此其可在最短的时间里,使样品得到最有效的分离。Lian Wang等[36]使用UPLC-DAD在268 nm波长下建立了快速筛查牛奶中头孢哌酮等十种抗生素残留检测技术,检出限0.003～0.022 μg/g,定量限0.01～0.08 μg/g。刘浩等[37]利用UPLC技术对于头孢噻吩钠中的3-位置异构体杂质进行了检测,采用苯己基三键键合亚乙基桥杂化颗粒柱,以0.05 mol/L甲酸铵缓冲液-乙腈-甲醇(85∶9∶6)为流动相对原料进行分离,254 nm作为检测波长,检出限0.064μg/mL,定量限为0.214μg/mL。

2.3.2液相色谱-质谱联用法(LC-MS)LC分析法中,光学检测器无法对待测样品进行结构分析鉴定,LC-MS技术集合液相色谱的高分离效率和质谱检测器的高灵敏度,近年来逐渐成为动物源性食品抗生素残留的检测领域使用最广泛的技术之一。在头孢菌素的鉴定方面,Xiaodan Liu等[38]使用亲水相互作用色谱柱,应用LC-MS/MS检测技术成功对牛奶中的其中头孢类抗生素残留进行了分离鉴定,对比传统反相HILIC亲水柱,其分析速度和分离效率都有明显提高,线性范围内R2大于0.999,样品检测平均回收率100.57%,方法检测限(LOD)0.44 μg/mL,定量限1.47 μg/mL。我国也已经有牛奶和奶粉中部分头孢菌素类抗生素残留检测的LC-MS/MS技术相关国家标准[39]。

UPLC-MS联用技术集合了UPLC分离时间短、效率高和质谱检测器高灵敏度、高选择性的优势,成为抗生素检测领域十分具有发展前景的分析技术[40]。研究学者[41]应用该技术建立了头孢呋辛的快速定量检测技术,在0.5 mL/min流速下,对于该物质的分析时间仅为1 min,定量限为0.1 μg/mL,回收率水平良好为99.94%～100.47%,样品检测相对标准偏差稳定在2%以内。但该技术也存在仪器配件耗材费用较高,需要配备独立色谱柱等局限性,且已经被开发出的检测方法相对于HPLC等技术还较少,残留检测时往往需要对检测方法进行摸索开发。

除较为普及的三重四极杆质谱检测器外,Q-TOF[9]和Q-Exactive(四级杆-轨道阱串联质谱)[42]等高分辨率质谱检测器和液相色谱技术的联用也为动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留的检测筛查提供了较为可靠的技术支持。

2.3.3毛细管电泳法毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳,它是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的高效分离技术,具有仪器简单、分析速度快、样品和试剂耗用量少、经济环保等特点,左艳丽[43]将毛细管电泳法应用于头孢菌素等抗生素药物的检测中,建立了毛细管带电泳法同时测定头孢曲松钠和左氧氟沙星含量的检测方法,其中对于头孢曲松钠的检测达到了2.5 μg/mL的检出限和8.3 μg/mL的定量限,在10～500 μg/mL范围内线性范围良好R2>0.999,平均回收率99.15%。

近年来该法被研究学者应用于食品领域中[44],开发出一系列残留检测技术。紫外检测器和电化学检测器是在毛细管电泳技术中最常用的两种检测器,近年来还有CE与质谱检测器相连进行生物化学等物质检测的相关报道[45]。但由于该法使用的毛细管直径小,导致光路变短、灵敏度偏低,分离重现性较HPLC技术相对欠缺,在食品中抗生素残留检测领域也同时存在一定的局限性。

3　结语

在动物饲养过程中,抗生素滥用问题频发,当前对于兽药残留的研究趋势是通过仪器分析建立高通量的筛查手段,对食品中兽药、农药残留做以全面监控。但在现阶段技术水平支持下,高通量筛查除过分析仪器维护、检测费用高之外,也同样存在由于通量过大而引发的方法专属性不高、部分兽药、农药定量不够准确等问题。在高通量的前提下,开发出专属性好、检测成本低、快速高效、更为精准的检测技术是食品安全领域亟待解决的问题,就目前的发展趋势来看,动物源性食品中头孢菌素类药物残留检测方式还具有相当大的发展空间。

3.1检测方法多样化

我国动物源性食品中头孢菌素类抗生素残留的检测相关研究与其他种类兽药残留的研究相比仍显不足,有关食品中该类抗生素残留的检测分析方法还不够成熟。就目前的研究趋势来看,除了完善免疫分析快速检测技术、研发更为先进且专属性强、灵敏度高的快速检测产品外,分析方法多样化亦是当今残留分析相关研究的热点。

SELEX即指数富集的配基系统进化技术,适配体作为一种前沿生物材料在食品安全检测领域具有重要作用[46]。当前国内有学者将适配体技术成功应用于食品安全检测领域[47],相比传统免疫学检测技术而言,核酸适配体分子小、无免疫原性的特征在抗体的制备上体现了极大的优势,且该技术特异性高、可识别结构十分类似的物质并实现高通量检测。应用方面,研究人员[48]在ELISA技术的基础上,成功使用酶联适配体建立了蜂蜜中四环素等抗生素的检测技术。

原位检测技术在食品安全领域的成功应用解决了常用食品检测方法分析时间长、前处理步骤繁琐等问题[49],近年来主要应用于初级农产品中农药残留[50]及非法添加剂[49]等物质的检测中。

3.2检测仪器微型化

“现场、快速、便携式”一直以来都是国内外分析仪设备研究关注的重点。便携式质谱仪的研发[51]与应用成功将真空泵最小化,检测特异性和灵敏度大大增强,仪器信噪比可提升为传统方式的2～10倍,该技术现已应用于农药残留和化妆品的检测中,实现了小型质谱仪与原位采样技术相结合。针对第二代质谱仪扫描速度较慢的缺陷,现已经研发出将扫面速度大幅提升的第三代质谱仪,平均为0.1～0.2 s扫描一次。

相信随着新技术的不断应用优化,定会在现有水平上攻克更多难题、取得较大突破,为食品安全监控及现场检测提供可靠的技术支持。

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Research development of detection methods of cephalosporins in food

HONG Yun-he1,2，LI Wei-qing1，LIN Zhong1,3，ZHANG Yuan1，ZHANG Jing-hua4，LIU Yan4,ZHANG Bao-shan2,ZHANG Feng1,*

(1.Chinese Academy of Ispection and Quarantine,Beijing 100176,China；2.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China;3.Comprehensive Technical Service Center of Putian Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Fujian Putian 351100,China;4.Beijing Center for Physical & Chemical Analysis,Beijing 100089,China)

Food safety problems caused by the abuse of antibiotics in animal breeding process has caused widespread concern in the community. There are nearly 60 kinds of cephalosporins have been used in clinical and veterinary fields. In order to fully understand the detection technology research status of the cephalosporin antibiotics,this paper summarizes the application of detection technology on cephalosporin antibiotic residues in food,foucusing on the sample preparation and detection methods and discussions of the trends of food cephalosporin antibiotic residues detection technology.

cephalosporins;animal derived food;detection;residues

2015-11-23

洪云鹤(1992-)，女，硕士在读，研究方向：农产品加工及贮藏工程，E-mail：hong_yunhe@163.com。

张峰(1974-)，男，博士，研究员，研究方向：分析化学，E-mail：fengzhang@126.com。

北京市科技计划(Z141100002614020)；国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ14000806)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)13-0370-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.068