猪瘟流行病学及诊断方法研究进展

陈　强，梁礼南2（.广西壮族自治区桂平市江口镇水产畜牧兽医站，广西 桂平 537229；2.广西壮族自治区玉林市安胜动物科技有限公司，广西 玉林 537000）

猪瘟流行病学及诊断方法研究进展

陈强1，梁礼南2
（1.广西壮族自治区桂平市江口镇水产畜牧兽医站，广西 桂平 537229；2.广西壮族自治区玉林市安胜动物科技有限公司，广西 玉林 537000）

摘要：本文从猪瘟流行病学及诊断学等方面阐述了猪瘟目前的流行特点及其诊断方法的研究进展，为基层动物防疫工作人员充分了解该病提供参考。

关键词：猪瘟；流行病学；诊断方法

为了充分认识猪瘟的流行现状，促进防控工作有效开展，本文就猪瘟的流行、诊断方法等进行综述。

1　猪瘟流行病学

1.1临床发病特点

1.1.1呈散发性流行且发病表现温和。当前猪瘟的流行形势从频繁发生的大流行性转为地区性、散发性流行。在发病表现上，既有高死亡率的急性、典型猪瘟，又有持续感染的温和型、非典型猪瘟，还有无名高热或隐性猪瘟。

1.1.2发病日龄偏小。仔猪发病急，病死率高，特别是断奶前后和出生10日龄以内的仔猪较为多见。成年猪发病较轻或耐过（隐性带毒），病理变化不明显，需进行实验室检测确诊。

1.1.3与其他疾病混合感染的现象比较普遍。猪瘟常与蓝耳病、伪狂犬病、猪肺疫、弓形虫病、猪丹毒等病混合感染，并多继发链球菌病、副猪嗜血杆菌病、气喘病、附红细胞体病及仔猪副伤寒等［1］，导致病情复杂，给诊断和治疗带来了很大难度。

1.2病毒基因型据报道，目前我国流行的猪瘟病毒基因型主要为基因2群，占74.66%，基因1群只占25.34%，而我国的猪瘟兔化弱毒疫苗株为基因1群［2］。可见猪瘟病毒基因型已发生重大变化。

1.3猪瘟病毒的主要储存宿主种猪持续感染且带毒是我国猪瘟难控制的重要原因，种猪已成为猪瘟病毒的主要储存宿主。目前，在实验室条件下已首次成功地利用猪瘟野毒人工复制带毒母猪动物模型，此母猪可带毒750d，甚至可以终生带毒、排毒，血液中的含毒量可达到105～106PFU/mL。利用该模型的带毒母猪自然交配或人工授精，可使使其产下带毒仔猪，用健康阴性猪与之同居，会造成同居猪感染。另外，利用RT-PCR方法检测猪瘟病毒的基因型，发现带毒公猪的病毒基因型与其自然交配所产死胎的病毒基因型是一致的，说明猪瘟病毒能通过公猪精液垂直传播。

1.4猪瘟免疫目前有些猪场经常出现免疫过了猪瘟疫苗还是有猪瘟发生的问题，分析免疫失败的原因，可能存在以下情况：（1）种猪存在持续感染和带毒现象，导致出生仔猪往往成为持续感染者，这种感染猪不能建立中和性抗体应答，形成免疫耐受；（2）圆环病毒、伪狂犬病毒和猪蓝耳病病毒的混合感染可造成猪瘟病毒在体内滞留而形成持续感染，影响猪瘟疫苗的免疫效果；（3）由于我国猪瘟疫苗中的病毒含量比国际标准差得远，免疫剂量不足而易导致免疫失败。

2　诊断方法

目前，根据不同的实验原理建立了许多猪瘟检测方法，概括起来可分为三大类，分别为病原学方法、血清学方法及分子生物学方法。

2.1病原学方法对CSFV的直接分离鉴定是诊断猪瘟最为经典可靠的方法。取疑似病猪的组织如扁桃体、脾脏、淋巴结等经过一些处理后接毒于PK-15细胞或猪睾丸细胞上培养，然后用CSF免疫荧光抗体法或免疫酶染法检查，可检测出细胞培养中细胞浆内的病毒抗原，亦可将分离的病毒回归到健康猪体内，出现猪瘟的典型症状即可确诊［3-4］。病毒分离鉴定方法特异性高，是诊断CSFV最为可靠的方法，但耗时较长、成本高，不易在临床中推广，比较适合科研院校研究用。

2.2血清学方法

2.2.1荧光抗体试验（FAT）。荧光抗体试验就是从高效价的特异性免疫血清提取IgG并荧光标记，然后利用抗原抗体特异性反应的原理，通过观察是否有荧光出现来判断是否有相应抗原存在的一种灵敏而又特异的诊断方法。猪瘟荧光抗体检测是目前国内外实验室诊断猪瘟最常用的方法。许多国家和地区将冰冻组织切片或触片的直接荧光抗体试验作为执行消灭猪瘟规划的法定诊断方法。可用FAT直接检测扁桃体、脾脏、肾脏和回肠远端冰冻切片中的抗原，尤以发病早期的扁桃体的检出率较高，也可将猪扁桃体和脾制成20g/L的混合匀浆后接种到无猪瘟病毒污染的猪源细胞（如PK-15）上，24～72h后进行飞片FAT试验，检查细胞中是否存在CSFV。此种病毒分离诊断方法比冰冻组织切片更为敏感。此试验需要注意消除非特异性染色，设置已知阴性和阳性标本以及荧光抑制试验等条件，以提高试验的准确率。戴爱玲［5］利用荧光抗体技术对20头不同病程的可疑病猪病料样品进行检测，结果表明该技术在猪瘟病毒感染早期的检出率较高，不仅能检出强毒抗原，还能检出低毒力病毒感染的带毒母猪。

2.2.2间接血凝试验（IHA）。间接血凝试验是利用CSFV或猪瘟免疫血清纯化的IgG致敏绵羊红细胞，将待检血清或病原梯度稀释后进行抗原抗体反应，根据红细胞的凝集情况判断结果。利用CSFV致敏绵羊红细胞的间接血凝试验称为正向间接血凝试验，利用猪瘟免疫血清纯化的IgG致敏绵羊红细胞的试验则称为反向间接血凝试验。正向间接血凝试验能够直观地测出抗体效价，具有简便、快捷、易操作的特点，目前在基层中使用广泛［6］，但不能区分是否为野毒感染。由于红细胞容易产生血凝现象，诊断液还容易因为红细胞处理不当而产生非特异性的血凝现象，所以在实际应用中容易出现结果偏差。反向间接血凝试验能够检测组织病料如脾脏、淋巴结、扁桃体中的CSFV抗原，但由于对组织病料的处理方法有差异，而且组织中的血细胞易造成干扰和非特异凝集，使得结果判定困难，因而现在已很少应用。

2.2.3酶联免疫吸附法（ELISA）。酶联免疫吸附剂法是指将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或酶联免疫测定仪判断结果的一种方法［7］。该法敏感性强、特异性高、检测速度快、易于标准化，是当前应用最广的一项检测技术。根据ELISA所用的固相载体不同可分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚酯布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗夹心ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。目前用于检测猪瘟抗体的ELISA方法主要有间接ELISA和阻断ELISA。蒋卉等［8］通过比较14种国内外猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的符合率，发现6种阻断ELISA试剂盒的符合率均可达到100%，在敏感性和特异性上整体优于另外8种间接ELISA试剂盒。双抗夹心ELISA法、夹心ELISA法及竞争ELISA法主要是检测猪瘟病毒抗原［9-11］。

另外，有学者利用CSFV特异性单抗和ELISA原理建立了区分猪瘟强、弱毒的ELISA抗体检测方法。丘惠深等［12］制备了CSFV石门株和弱毒疫苗株特异性单抗，并用亲和层析法将两种单抗分别制成单抗酶联诊断试剂。强毒单抗酶联诊断试剂可用于猪瘟的疫病监测，为净化猪场提供依据；弱毒单抗酶联诊断试剂可用于监测猪瘟疫苗免疫抗体，以准确评估群体免疫水平，考察猪群的免疫效果。这两种单抗酶联诊断试剂的应用，为猪瘟抗体的鉴别诊断奠定了基础。郑世军等［13］、郭振梅等［14］、李育林等［15］、陈振华［16］都用该单抗酶联试剂对临床血清样品进行了检测，取得了较满意的效果。

2.2.4胶体金免疫层析试验。胶体金技术是20世纪80年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术，具有操作简单、方便快速、特异性强等优点，非常适合基层兽医使用。其原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细层析作用，使抗原、抗体在固相膜上反应，以胶体金为标记物，阳性反应在膜上呈现红色，阴性反应则不显色。国内近年来也在猪瘟诊断上研究成功了许多诊断试纸条，如直接检测猪瘟抗原的诊断试纸条和检测猪瘟抗体的诊断试纸条。

2.3分子生物学方法自1983年KaryMullis发明聚合酶链式反应（PCR）以来，PCR技术就以其简便、迅速、灵敏等优点在分子生物学等领域得到了迅速的发展和应用，同样在猪瘟病毒检测上也有了广泛应用。比如RT-PCR技术、实时荧光定量PCR技术、环介导反转录等温扩增技术等。RT-PCR是一种以病毒RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法。陈本龙等［17］成功建立了一种能够区分猪瘟病毒强毒株和HCLV株的RT-PCR检测方法。该法从猪瘟强毒株和兔化弱毒株中扩增出了大小分别为680bp和785bp的特异性片段，具有高度的特异性和敏感性。实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，为猪瘟病毒的定量检测提供了新的分子生物学诊断技术。环介导等温扩增（LAMP）方法是日本学者Notomi等在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术，具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，特别适合在现场和基层部门应用。张改平等［18］建立的猪瘟强弱毒LAMP检测方法，特异性好，比RT-PCR灵敏度高出1000倍，且重复性和稳定性良好，为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种感染提供了有效的方法。

3　小结

目前猪瘟的流行已经由以前的大流行转变成散发或地方性流行，发病日龄也逐渐变小，更严重的是种猪的隐性感染易导致猪瘟持续存在，加之易与其他疾病混合感染，使得猪瘟防控的任务十分艰巨。猪瘟弱毒疫苗在我国的大规模应用使得猪瘟强毒、疫苗弱毒的鉴别诊断成为有效防控猪瘟的拦路虎。虽然现在建立了许多鉴别强、弱毒的检测方法，但能显示出巨大发展潜力和广阔应用前景的应该是基于单克隆抗体的胶体金免疫层析试验。该方法具有简单、快速，不需特殊仪器、可肉眼判别的优点，非常适合基层兽医部门和广大养殖户使用。■

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中图分类号：S852.651

文献标识码：A

文章编号：1001-8964（2016）06-0030-03

收稿日期：2016-05-05

作者简介：陈强（1979-），男，广西桂平人，助理兽医师，本科，主要从事动物临床、动物疫病预防控制工作。

Research on the Progress of Epidemiology and Diagnosis Method of Classical Swine Fever

CHEN Qiang1，LIANG Linan2
（1.Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Station of Jiangkou Town in Guiping City，Guangxi Guiping 537229；
2.Ansheng Animal Science and Technology Limited Company in Yulin City，Guangxi Yulin 537000，China）

Abstract：In this paper，we reviewed the latest progress of epidemiology and diagnosis method of CSF，in order to provide a reference for animal epidemic prevention staffs understanding CSF.

Key words：Classical swine fever（CSF）；Epidemiology；Diagnosis method