禽白血病病毒检测技术研究进展

周云锋 边海霞 王学强 郭 磊 徐源佑 张 冉 王 洁 王 翔

（1.宁夏晓鸣农牧股份有限公司，宁夏银川 750021；2.宁夏家禽技术研究中心，宁夏银川 750021）

禽白血病病毒检测技术研究进展

周云锋1，2边海霞1，2王学强1郭 磊1徐源佑1，2张 冉1，2王 洁1，2王 翔1，2

（1.宁夏晓鸣农牧股份有限公司，宁夏银川 750021；2.宁夏家禽技术研究中心，宁夏银川 750021）

禽白血病作为传染性免疫抑制病已然成为了我国乃至世界禽业最难控制的疾病之一，只有通过净化手段才能控制，而检测手段的可靠性、迅捷性在诊断中起着至关重要的作用，本文就近些年常用的新型的检测技术做了简要的综述，为实验室诊断方法的选择提供参考。

禽白血病病毒（ALV）；检测；进展

禽白血病（Avianleucosis virus，ALV）是由反转录病毒科，慢病毒亚科，α反转录病毒属的禽白血病病毒引起的禽类肿瘤性疾病，ALV已分类至A～J、K11个亚群，亚群间及各毒株间基因组十分相近，但不同亚型病毒可引起不同的肿瘤；A、B、C、D亚群是引起禽白血病肿瘤，E、F、G、H、I亚群为内源性病毒，在鸡群中普遍存在。J亚群从肉鸡中分离得到的，据推测是重组体，主要诱发髓细胞白血病，该亚群病毒宿主广泛，感染后，致病率、死淘率高，已经是我国严重的传染性疾病之一；K亚群禽白血病为2012年报道的从我国地方品系中发现的新亚群。目前禽白血病检测方法主要有传统的病毒分离后鉴定、基于血清学的抗原和抗体检测、分子生物学检测。本文就近些年来主要的检测方法进行了简述。

1 病原分离和鉴定

病毒分离虽然对临床诊断意义有限，但对新毒株的鉴定、疫苗安全性检验、净化鸡群的病毒检测非常有用。可以取患病禽的全血、组织、口腔、泄殖腔拭子、蛋清、肿瘤、羽髓、精液等。ALV病毒可以在细胞中增殖但不形成病变，该病毒在鸡只体内能形成肿瘤病变。ALV病毒对热敏感，-60℃以下可以长期保存。增殖培养后通过PCR等方法对病毒进行鉴定，经该方法鉴定后，可为鸡群诊断提供准确依据，但费用高、耗时长、技术要求高、工作量大、对体内潜伏感染的病毒敏感性较低，只适合小批量样品检测。

2 基于血清学的抗原、抗体检测

2.1 病毒中和试验

中和试验（NeutralizationTest）是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。中和试验具有较高的特异性，是亚群分类的基础之一，只要抗体与病毒粒子上的表面抗原相对应就能取得良好的效果，被称为检测ALV抗体最特异的方法[1]，但ALV分离物中存在多种蛋白质，可能干预抗体与抗原结合，造成结果偏差。这种方法可大量检测样品，但制备单一抗原费用较高，推广较慢。

2.2 琼脂扩散试验

琼脂扩散是利用抗体与抗原在固体支持物琼脂上，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物或颜色反应。该方法可以从5日龄以上的鸡只用羽髓检测ALV病毒抗原，该方法易于推广，操作简单、费用低廉，能在两日内获得结果，但在拔出羽翼时容易造成鸡群应激反应，而且精确度较差，假阳性较高，在实际操作中困难较大。

2.3 ELISA检测

酶联免疫吸附测定（ELISA）技术适用于包括蛋清、血清、胎粪、泄殖腔棉拭子等多种样品的检测。在生产中常通过ELISA方法检测ALV抗原或抗体来诊断鸡群ALV感染情况。

国外已经建立了包括J亚型在内的不同亚型抗体ELISA检测试剂盒和p27抗原ELISA检测试剂盒。国内于1987年首次引用ELISA检测ALV[2]，自此国内大批研究人员开始研制、开发ELISA试剂盒，仇钰等[3]包被p27-GST融合蛋白建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法，与进口禽白血病抗原检测试剂盒的检测结果基本一致，已基本达到国外同类产品的水平。

ELISA方法特异性、敏感性高，设备要求低，可作为一种有效的普检方法，适合大批量的流行病学调查和生产净化。目前，目前市场上已有用检测ALV-p27抗原和ALV-A、B亚型ELISA试剂盒出售，抗原检测较抗体检测在生产中应用较广，但不同试剂盒之间的敏感性存在差异[11]，而且与不同的病料组织敏感度不同，经反复试验发现蛋清和棉拭子是检测外源病毒的最好的病料[4，5]。虽然ELISA方法存在着诸多缺陷，但敏感性仍远高于AGP，在疾病快速检测和ALV检疫及净化方面发挥着一定作用[6，7]，可是ELISA检测在临床有假阳性出现，因此只用于普查而不用于确诊。

2.4 IFA方法

免疫荧光试验（IFA）可对抗原进行细胞定位，荧光抗体试验特异性强，可对待检病料作出快速诊断，所需时间较短。细胞抗原上的每个分子结合3～5个抗体分子，当此抗体作为抗原时又可结合3～5个荧光抗体分子，因此单克隆抗体的间接荧光抗体法敏感性与特异性比较强，虽然该方法一直被研究并取得了良好的效果，但有时病料所产生的非特异性荧光干扰实验结果，因此IFA检测方法只适合实验室检测。

3 病毒核酸检测

ALV基因结构为：5’-（R-U5）-gag/pro-pol- env-（U3-R）-3’，编码ALV-A～E亚群的env基因中的gp85序列中存在hr1和hr2两个高变区，vr1、vr2和vr3三个相对保守区，可以反映不同亚群间的差异。J亚群gp85的序列在不同株间差异也很大，特别是高变区，因此通过E亚群和J亚群设计的不同引物，通过PCR等方法可以对ALV分离株进行分群。

3.1 PCR检测

聚合酶链式反应（PCR）可以对微量的DNA或RNA进行检测，大大提高了检测准确性和可靠性。Hatai H等[22]用基因组3’非编码区设计的引物建立了高灵敏度的巢式PCR法；金志强等[23]以单管套式PCR方法排除了E群内源性病毒干扰，检测外源性ALV的长末端重复序列LTR，取得良好的效果；周刚等[8]于2010年优化建立了同时检测并鉴别内外源性ALV的多重PCR方法。PCR和RTPCR方法是基于DNA和RNA的检测技术，受到病毒的env基因序列和正常鸡群中同源基因的干扰，另外还受到基因突变、重组、缺失等因素的困扰，这使得PCR的使用变得越来越复杂，因此至今未能找到一种方法能快速诊断ALV病毒，同时对该和病毒进行的快速分型。

qRT-PCR是一种实时定量检测特定核酸的技术，它是PCR技术与核酸探针技术的结合产物，能实现多重反应自动化。Kim Y B等对J亚群病毒RNA定量化的结果显示：qRT-PCR法较Qc-RT-PCR、TCID50、ELISA等方法特异性强、易于操作、重复性好。王峰[9]等根据ALV-J env和pol基因保守序列设计的引物建立了SYBRGreen I RT-PCR检测ALV的方法，该方法不需要设计探针，因此灵敏度比不同PCR高出1000倍，为ALV-J早期快速诊断及种鸡场净化提供了一种新的检测途径。

3.2 LAMP检测

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种崭新的体外恒温核酸扩增方法。与PCR相比LAMP扩增反应的全过程均在同一温度下进行，大大简化反应程序，降低了仪器的要求，缩短反应时间。刘业兵等[10]根据ALV病毒基因组保守序列区域设计了多套LAMP引物，缩短试验时间同时建立了可视化RT-LAMP方法，结果表明与原检测结果基本一致。康忠惠[11]根据针对gp85区段设计了两组分别用于检测A、B亚群禽白血病的LAMP引物，建立了可视化LAMP方法该方法，实现了对A、B亚群的快速检测。

3.3 Dot Blot方法

斑点杂交（Dot Blot）是用已标记的探针与待测的DNA或RNA进行杂交，再将探针的标记物显色或显影，直接判断样品中是否存在该基因片段，通过放大该方法能发现微量DNA。近年来也有很多科学家将Dot Blot技术引入到禽白血病的检测中，2010年周刚[12]将特异性P27抗原基因的部分片段做成了Dot Blot探针，应用于禽白血病诊断，但该方法无法分辨内源禽白血病；2011年崔治中等[13]发明的Dot Blot试剂盒不但能区分内源和外源禽白血病病毒，还可以确定A～J亚型，该方法是目前经实验室验证的最为准确的检测方法[14-16]。

4 结语

鸡是ALV的自然宿主，感染后可导致病鸡发育缓慢、产蛋率低、良性和恶性肿瘤等，是一种慢性消耗性疾病，而且是一种免疫抑制性疾病，引起机体抵抗力下降和免疫抑制，导致其它疾病的继发感染，是危害养鸡业的主要疾病之一；ALV可通过垂直和水平两种传播方式自然感染鸡群，而一些禽源生物制品中含有的禽白血病病毒是跨地域传播的主要方式。禽白血病没有有效的疫苗防疫和药物治疗，主要通过淘汰感染种鸡，不断净化鸡群，以控制禽白血病传播，因此检测方法的可靠性、灵敏度、可操作性对白血病的防控至关重要。传统方法分离病毒后鉴定，虽然能准确诊断病鸡群，但多数都要在15天以上才能完成检测，不利于传染性的ALV控制；基于血清学的检测虽然能大面积普及，但受到补体和内源性ALV等因素的干扰准确性较低；PCR方法虽然敏感性高、可操作性强，但受限于ALV病毒基因组的快速变异，需不停的改进方法，在实际操作中干扰因素较多。因此对ALV的检测需多种方法结合的“组合拳”并进行多次随机检测，避免某一种方法的缺陷造成的漏检现象。血清学检测时需注意，ALV抗体高只说明感染过病毒，不能说明鸡体内存在病毒；一些其他免疫抑制性病毒，可能提高机体排毒，而抗体水平不升高。

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