如何发挥兽医实验室检测的最大效能

胡志刚 杨保华 （新疆生产建设兵团第六师新湖农场 新疆 玛纳斯 832208）



如何发挥兽医实验室检测的最大效能

胡志刚 杨保华 （新疆生产建设兵团第六师新湖农场 新疆 玛纳斯 832208）

随着养殖业对生产系统和管理思维的不断突破，致使规模化养殖场生产体系重心也发生转变，由以前的以生产性能、疫苗免疫和药物保健为重点的生产体系转变为以人才培养、繁育体系和健康管理为重点的生产体系。而生产体系的本质就是如何发现问题、进行决策、解决问题、群体健康预警、评价群体健康状况是否得到改善，实验室检测是重要的技术手段的之一。新时代下，畜牧人已经认识到实验室检测在种畜源头净化、疾病风险预警、免疫效果评估、疾病传播控制和协助健康管理等方面的价值。专业的实验室检测是一个非常缜密的系统工程，包含检测前、检测中、检测后3个关键点。

1 检测前：样品背景和样品统计意义

背景是指所采样品主体的生产性能、用药和免疫情况及临床现状；样品统计意义是指所采集样品要具有统计学意义，可以按生产阶段连续性系统采样(如公猪群、后备母猪群、生产母猪群、仔猪群、保育猪群、育肥猪群)，也可以紧密结合免疫程序采样(仔猪分周龄，母猪分胎次连续采样)。重点监测群体和时间点可以按照以下方式进行(以猪为例)：

1.1 生产母猪群 （1）母猪群健康关系仔猪保育期间的成活率：猪场疾病的根源来自于种猪，种猪带毒、散毒是保育期仔猪难养的根源。（2）适宜母猪群检测的项目及时间：母猪的检测应选择母猪的特殊敏感期，在此阶段母猪免疫机能下降，容易发病或向外散毒，适宜检测的时间及项目有：①防控流行性腹泻于产前15～20d可采集奶水或肛门处的粪便，通过PCR和接种细胞检测病原，如果为阳性，可做紧急隔离、疫苗接种或返饲；②配种前后重点监测伪狂犬病毒，配种前后伪狂犬病毒感染可影响胚胎着床，通过抗体检测可确定配种前是否需要加强免疫伪狂犬疫苗；③种猪净化：空怀期活体采集扁桃体，检测猪瘟、伪狂犬和蓝耳病原，淘汰带毒种猪，这对于温和性猪瘟的净化尤其重要(我国的种猪的猪瘟带毒率为8～10%，导致猪场蓝耳爆发时形成免疫抑制往往表现为混感猪瘟)；④流产母猪管理：发生流产的母猪检测脐带血，如果确定为病毒性疾病导致的流产，短期内禁止配种。隔离至少3个月后再次检测病原，检测合格方可使用。

1.2 公猪群 （1）公猪关系生产安全：公猪主要提供优质精液，精液质量影响生产成绩。试验已经证实，部分病毒感染公猪精囊后可导致精液质量下降，如伪狂犬、圆环和蓝耳等。此外公猪精液带毒的还可在配种过程中感染母猪，这在伪狂犬的疾病传播途径中表现的尤为显著，因此需关注公猪精液检测，检测方法多用PCR；（2）公猪的检测时间：公猪应定期检测，最好每季度检测一次精液和血清。精液除常规镜检外，还需进行病原检测，如检测出蓝耳，则该公猪3个月内禁止采精；如精液中检测出伪狂犬病毒，则需坚决淘汰。公猪的伪狂犬检测应配合血清学检测，如血清学检测阳性，但精液病原为阴性，则此公猪需隔离饲养，加大伪狂犬疫苗免疫频次，预防病原向精囊传播，但其精液仍可用，不必淘汰该公猪。

1.3 后备种猪群 后备猪群的筛选需将抗体和抗原检测相结合，但筛选的时间需要做考量，考量标准参照病原的免疫持续期规律。如伪狂犬的母源抗体的持续期可达27个周，在伪狂犬阳性场(但生产基本稳定)的采血时间需要在27周后(因为如果没有病原中和母源抗体，其母源抗体将持续至27周，因此筛选时应注意区别对待)。其他病毒性疾病也有类似的考量，如蓝耳的持续感染期时间较长，病毒血症期易反复，这些因素均需考虑在内。

1.4 新引进种群 新引进的种群是猪场引进外来病毒的重要途径，新引进的种群的免疫程序与猪场现阶段的免疫程序存在差异(至少存在疫苗产商的差异)，所以有可能新引进的种群在原有的免疫程序下可保护猪群不发病，不散毒，但换用猪场的免疫程序后难以防控。因此对于新引进种群需做好以下工作：（1）严格的隔离，至少隔离3个月以上；（2）换用猪场的免疫程序后进行评价，评价合格后才可配种；（3）在一年内禁止混群，直到通过检测确定不散毒才可以考虑混群饲养；

1.5 保育群 保育期仔猪抵抗力差，是疾病感染高发期，所以在不稳定场不检测抗体。可以剖杀几头发病猪采集病料检测，提高检出效率。稳定场保育期间大多数疫苗免疫期已超过一个月，在此期间检测抗体，评价免疫程序，关键评价母源抗体是否产生了干扰，从而调整部分疫苗的免疫程序。

1.6 育肥猪群 育肥猪群是容易被忽视的猪群，此阶段猪的抵抗力强，疾病感染后往往不表现出非常严重的症状，但会影响饲料报酬。举例说明，伪狂犬对育肥猪的危害主要在呼吸道疾病，导致咳喘，如有类似症状在咳喘后5d左右采血检测，如果检出病原为伪狂犬，在90～120日龄加强免疫1次，其产生的价值是比未做处理的育肥猪可提前至少5d出栏，经济效益远高于疫苗免疫成本。

2 检测中：系统的质量控制体系

系统的质量控制体系，是保证检测结果准确可靠地基础，检测方法所采纳的标准，检测仪器的合格使用，检测人员知识架构及技术操作的专业性，检测人员对诊断检测试剂的深入理解(根据检测目的，选择不同试剂)。实验室检测通用的方法及适用范围如下：

2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) （1）优点：操作简单，省时快捷，可同时检测多个样本，普通养殖场或兽医站即可考虑配置，对人员素质要求不高；（2）缺点：大部分试剂盒不能区分野毒和疫苗毒；其抗体滴度与具有保护性的中和抗体滴度无绝对线性关系，在蓝耳抗体检测尤为明显(即检出的抗体滴度是杂抗体的滴度，意味着抗体滴度高，保护力未必高，这只能作为疫苗免疫后产生免疫力或感染发生的依据)。（3）ELISA的适用范围：①稳定场的免疫程序评价：如首免日龄的确定，通过抗体检测可确定母源抗体是否存在干扰及最佳的免疫日龄；②检测疾病的感染率：适用于未做某种疫苗的疾病的感染状态评估(伪狂犬除外)。③不稳定场通过检测抗体判断是否发病：是可以通过离散度和抗体滴度判定。由于病原感染和疫苗免疫均可以产生抗体，因此当疫情来临时，通过ELISA不能判定哪些抗体是疫苗产生的，哪些是病原产生的，因此必需结合病原检测(PCR)结果才能确诊。（4）ELISA检测的注意事项：①抗体检测需要足够的样本数：一般母猪群样本数至少10%，样本数过少，随机性太大，容易误判；②周期性的抗体检测数据更有价值：抗体检测应具有周期性，通过对比近期数据与前几年同时期的数据，对于猪场的科学决策具有参考价值。

2.2 聚合酶链式反应(PCR或RT-PCR)及基因序列测定（1）优点：针对性强、可确诊；可区分野毒与疫苗毒；q-PCR可确定病毒载量，确定发病的主因；（2）缺点：操作复杂，需专业人员操作，责任心强；要求较高，专业人员需要有深厚的分子生物学基础，了解病原的基因结构，此外还需要有方法的支持(针对不同病原，不同基因型的多套可靠的引物序列)。大型规模场从数据真实准确的角度上考虑也需要考虑配置，如不能配置也需要有可靠的合作单位。（3）PCR及测序适用范围：①疾病诊断，确定多种病原，适用于分析发病的主因；②通过测序可确定病原基因型，便于对症用苗；对蓝耳的免疫尤为重要。（4）PCR及测序注意事项：①不稳定场首先应考虑采用PCR检测病料；②PCR检测应保证病料的新鲜，路途较远时需冷冻后送检；③检测时避免污染，实验室中应有相应的设施确保不出现气溶胶污染。

2.3 细胞培养相关试验 体外培养的细胞可以模拟动物试验体内的结果，也可用于活毒的扩繁、毒价的测定等工作，是未来发展的方向。目前在几个大集团均有此设施，但该实验室对洁净程度和操作人员素质要求特别高，需要生物安全柜和相应的细胞室，可以完成以下几方面工作：（1）病毒分离鉴定：分离纯化病毒，便于进一步分析病毒的致病性。（2）交叉中和试验：利用分离的毒株进行交叉中和试验，可更科学地判断疫苗免疫的中和抗体对猪场分离株的中和效果，其评估的结果优于基因测序比对。（3）血清驯化：比在活体动物上繁殖病毒安全性更高，更稳定。（4）毒价测定：可用于测定疫苗毒价或“返饲”材料的毒价；如流行性腹泻“返饲”成功要素有以下两要点：①“返饲”材料纯净，无PCV2和PRV等病原。②毒价确定，“返饲”的病毒量需要滴定，否则母猪返饲后有散毒风险；而这些问题可通过PCR及细胞相关试验解决。

3 检测后：检测数据的分析

对检测数据的分析，数据分析需要精通专业知识，掌握分析指标。

3.1 专业知识 系统的免疫基础知识，如首免与二免的作用；母源抗体与半衰期(持续时间)；免疫后产生保护及能检测到的保护抗体的时间；检测试剂及其所测指标的意义：（1）猪瘟一免后无一例外地表现出抗体水平下降的趋势，二免后表现出显著地保护抗体上升。（2）母源抗体的半衰期：PRVgB抗体一般可维持至8～10周，CSFV抗体4～6周，而PRVgE抗体可以维持至13～16周龄。（3）疫苗免疫保护与抗体消长规律。通常情况下，活疫苗免疫后1～2周产生保护，而2～3周试剂才能检测到保护指征性抗体，而灭活疫苗分别为2～3周和3～4周。（4）检测试剂及其所测指标的意义：不同公司的试剂盒，其设计原则及检测指标的意义不同，不同试剂盒抗体阳性指征性完全不同(即与免疫保护力的关系不同）。例如核衣壳蛋白(N蛋白)包被的蓝耳病抗体ELISA检测试剂盒，检测早期感染抗体，与SN检测结果没有相关性；膜蛋白(M蛋白)包被的蓝耳病抗体ELISA检测试剂盒；与IFA 或者IPMA方法相似，与SN抗体有一定的相关性，可在一定程度上反应免疫保护效果。

3.2 分析指标 主要从免疫评估和群体野毒感染/压力监控两方面分析。（1）免疫评估包括抗体阳性率、抗体水平(抗体平均值，群体内个体分布)及离散度。离散度在某种程度上比抗体水平更重要，一般情况下要控制在30%～40%，它反应疫苗免疫的均一性及操作的稳定性。（2）群体野毒感染/压力抗体监控：使用特异的抗体鉴别检测试剂盒(PRVgE抗体及FMDV3ABC抗体)；抗体水平异常高，离散度大，提示群体有感染风险；通过连续的跟踪监测(至少2～3次/年)和调整，设立养殖场的免疫基底线，离散度及抗体水平的突然异常作为养殖管理异动的信号，低于基底值，说明免疫有问题(疫苗、程序、操作等)，高于基底值，可怀疑感染。

总之实验室检测是一项系统工程，需要严格规范的硬件和软件条件，如机构的设备、实验室的环境、质量的品控、人员操作、专业的检测试剂等，而且检测的数据分析一定要与临床相结合，光看原始数据，非结合临床实践得出的检测数据是没有意义的。规模场可以筹建适合自身发展需要的实验室或与可靠实验室建立合作，发挥兽医实验室检测的最大效能。

收稿日期：（2016–01–07）

中图分类号：S851.33

文献标识码：B

文章编号：1007-1733(2016)03-0042-03