降糖通脉片对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤的修复作用*

宋新龙，鲁碧楠，苏冷高娃，陈 书，张耀丹，庞宗然

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

降糖通脉片对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤的修复作用*

宋新龙，鲁碧楠，苏冷高娃，陈 书，张耀丹，庞宗然△

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081)

目的:观察降糖通脉片对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的修复作用并探讨其可能的作用机制。方法:将40只昆明种小鼠按随机数字表法分成空白对照组、模型组、降糖通脉片组、阳性对照组(水飞蓟宾胶囊)4组各10只。预防性灌胃给药5 d后，通过腹腔注射0.2%CCl4花生油溶液，建立小鼠急性肝损伤模型，测定小鼠血清中ALT、AST、TG、TBIL、LDH和ALP水平及肝组织中MDA含量和SOD活力，计算肝脏指数并对肝组织进行病理学检查。结果:降糖通脉片组能降低CCl4导致的急性肝损伤小鼠肝脏指数和血清中ALT、AST等指标水平，降低肝脏组织中MDA的含量，增强SOD的活力。通过病理学检测，降糖通脉片组能明显改善肝脏组织的病理变化。结论:降糖通脉片对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤具有显著的修复作用，其作用机制可能与清除体内自由基和抗氧化应激有关。

降糖通脉片;急性肝损伤;四氯化碳;氧化应激

降糖通脉片是临床经常用来治疗2型糖尿病的中成药制剂，主要用于由气阴不足、瘀血阻络所致的2型糖尿病具备多饮、多尿、多食、消瘦等典型三多一少症状的患者［1］。本实验室前期研究结果显示，降糖通脉片不仅具有较好的降糖作用，而且能够显著降低2型糖尿病小鼠血清ALT和AST活性。目前对降糖通脉片的使用与研究仅限于糖尿病，对降糖通脉片的肝保护作用和其作用机制的研究报道甚少。本实验建立由CCl4导致的急性肝损伤模型是常见的一种化学性肝损伤模型，考察降糖通脉片对急性肝损伤的修复作用及其机制。

1 材料

1.1 实验动物

昆明种SPF级雄性小鼠，体质量22 g～25 g，由中国食品药品检定研究院提供(动物合格证号SCXK(京)2014-0013)。

1.2 试剂与药品

降糖通脉片由江苏万高药业有限公司提供，称取降糖通脉片10 g研磨至粉末，用适当倍体积的二蒸水超声溶解，最终得到0.063 g·mL－1药液。

氯化钠、无水乙醇、冰醋酸及四氯化碳均购自北京化工厂;水飞蓟宾胶囊购自天士力制药集团股份有限公司;谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆红素(TBIL)、乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(ALP)试剂均购自中生北控生物制剂科技股份有限公司;丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;BCA蛋白含量测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究院;肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素1(IL-1β)Elisa测定试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 主要仪器

全自动生化分析仪(日立公司，日本);电热恒温水浴锅(荣华仪器制造有限公司，江苏);UV-4802H型紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司，上海);BioTek多功能酶标仪(伯腾仪器有限公司，美国)。

2 方法

2.1 分组及给药方法

将40只小鼠按随机数字表法分成空白对照组(Control)、模型组(Model)、降糖通脉片组(JT)和阳性对照组(Silibinin)4组各10只。降糖通脉片组灌胃给予0.63 g·kg－1降糖通脉片水溶液，阳性对照组灌胃给予54.6 mg·kg－1水飞蓟宾胶囊水溶液，正常对照组和模型组灌胃给予等剂量蒸馏水，每天灌胃给药1次，连续给药5 d。第5天给药2 h后，模型组、降糖通脉片组、阳性对照组小鼠分别腹腔注射0.2%(v/v)CCl4花生油溶液，正常对照组小鼠注射等量花生油，随后禁食不禁水。

2.2 标本采集与制备

造模23 h后眼眶取血，将血液于4℃、3500 rpm离心12 min制备血清，用于检测各组小鼠血清中生化指标(ALT、AST、TBIL、TG、LDH、ALP)及炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的含量。同时立即脱臼处死小鼠取肝脏，用4℃预冷的生理盐水冲洗表面浮血，滤纸拭干、称重计算肝脏指数。取小鼠肝脏最大叶置于10%福尔马林中固定用于病理学检查。称取0.2 g肝脏组织，剪碎放于玻璃匀浆器中，加预冷的9倍体积生理盐水匀浆，3000 rpm离心10 min，上清液置4℃保存备用，按照Elisa试剂盒说明测定肝脏组织中MDA、SOD水平。

2.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，所有实验数据以均数±标准差(±s)表示，2组间均数采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 降糖通脉片对肝脏指数(Liver index)的影响

表1显示，与空白对照组比较，模型组小鼠的肝脏指数显著升高(P＜0.05)，说明模型组肝脏增大。与模型组比较，降糖通脉片组肝脏指数显著降低(P＜0.05)，说明降糖通脉片对由CCl4导致的小鼠肝脏肿胀有一定的缓解作用。

3.2 降糖通脉片对肝脏组织中MDA和SOD的影响

表1显示，与空白对照组比较，模型组小鼠肝脏MDA含量明显升高(P＜0.05)，SOD活性显著降低(P＜0.05)，再次证实本实验小鼠急性肝损伤造模型成功。与模型组比较，降糖通脉片组肝组织中SOD的活性明显升高(P＜0.05)，MDA的水平显著降低(P＜0.05)。与水飞蓟宾胶囊阳性对照组比较差异无统计学意义，作用效果相当。结果显示，降糖通脉片具有一定的保肝活性，对肝损伤有明显的改善作用。

表1 降糖通脉片对小鼠肝脏指数以及血清中MDA和SOD的影响

3.3 降糖通脉片对血清中ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP的影响

与空白对照组比较，模型组血清中ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP水平明显升高(P＜0.05)，证实本实验小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组比较，降糖通脉片组小鼠血清ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP水平明显降低(P＜0.05)，与水飞蓟宾胶囊阳性对照组比较差异无统计学意义，作用效果相当。

表2 降糖通脉片对血清中的ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP的影响

3.4 降糖通脉片对血清中IL-1β、IL-6和TNF- α含量的影响

图3显示，与空白对照组比较，模型组血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量明显升高(P＜0.05)，证实本实验小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组比较，降糖通脉片组小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明显降低(P＜0.05)，与水飞蓟宾胶囊阳性对照组比较差异无统计学意义，作用效果相当。

表3 降糖通脉片对血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响

3.5 降糖通脉片对肝组织病理变化的影响

肝脏组织HE染色显示，正常对照组肝小叶结构清楚，肝脏组织完整，未见异常变化。而模型组尽管肝脏组织结构轮廓尚且存在，但血管周围出现大量炎性浸润，肝细胞变性、坏死。与模型组比较，降糖通脉片和水飞蓟宾不同程度地改善CC14诱导肝损伤中肝细胞炎性浸润、水肿、变性、坏死等病理改变。

肝脏组织油红O染色显示，正常对照组肝小叶结构清楚，肝脏组织完整，未见异常变化和脂滴沉积。而模型组尽管肝脏组织结构轮廓尚且存在，但在门静脉周围出现大量脂质沉积和肝细胞脂肪变性。与模型组比较，降糖通脉片和水飞蓟宾不同程度改善了CC14诱导的肝损伤中肝细胞脂滴沉积与脂肪变性等病理改变。

4 讨论

降糖通脉片的主要成分为太子参、黄芪、黄精、天冬、麦冬、玄参、天花粉、苍术、知母、葛根、黄连、丹参、益母草、赤芍、水蛭、川牛膝、鸡血藤、威灵仙、荔枝核、地龙和川芎，其功效为益气养阴、活血化瘀、通络活络，主要用于气阴两虚、瘀血阻络所致的消渴，多饮、多食、多尿消瘦、乏力以及2型糖尿病具备以上症状的患者。中医学认为，急性肝损伤其发病机制为外来毒邪是病因，正虚是发病的关键，血瘀是主要证候，因此祛毒增液、益气养阴、活血化瘀可谓是治疗急性肝损伤的基本治法。虽然在降糖通脉片中解毒药不多，但益气、养阴、增液、活血的药比较多，因此根据“有是证用是药”的原则，降糖通脉片具有一定的肝损伤修复作用。同时在实验中也偶然发现，降糖通脉片对2型糖尿病小鼠的谷丙转氨酶和谷草转氨酶具有降低作用，因此初步得知降糖通脉片对肝脏具有保护作用，但需要进一步深入研究其保护作用及其机制。因此，经查阅文献采用CCl4急性肝损伤模型为本研究的研究对象，CCl4急性肝损伤模型是经典的肝损伤模型，常被用来筛选具有肝保护作用的药物［4］。CCl4进入机体后，经肝脏细胞色素P450代谢产生三氯甲基自由基和过氧三氯甲基自由基，破坏细胞膜结构，造成肝细胞脂质过氧化损伤。脂质过氧化损伤破坏肝细胞膜的完整性，从而导致肝细胞的AST和ALT释放入血，因此血清AST和ALT活性水平被认为是肝损伤最敏感的金指标，并被广泛应用于对急性肝损伤的诊断［5］。研究结果显示，降糖通脉片以0.063 g"mL－1的剂量对小鼠进行预处理，能显著降低AST、ALT、TBIL、TG、LDH和ALP的活性，说明降糖通脉片具有明显的肝保护作用。为进一步深入探讨降糖通脉片的肝保护作用机制，本研究对肝损伤小鼠的肝脏MDA和SOD水平、血清中炎症因子与肝脏形态进行了分析。MDA是脂质过氧化的终产物，肝损伤越严重其含量越高，MDA还可以增加细胞膜通透性，加速肝损伤过程［6-9］。SOD是机体抗氧化应激的酶防御体系中的重要酶，能有效地清除体内自由基，保护机体组织免受自由基的攻击［10-14］;炎症反应在CCl4诱导的肝损伤过程中扮演着重要角色。自由基可激活单核细胞和巨噬细胞产生大量肿瘤坏死因子(TNF-α)，TNF-α能引起肝细胞坏死，并可激活Bax和Fas等基因表达引起肝细胞凋亡，且能介导脂类介质、多肽介质(IL-6、IL-1β)和氧自由基而引起肝损伤［15-16］。因此，抑制MDA水平并增加SOD活性与降低TNF-α等炎症因子表达水平，能够拮抗CCl4诱导的急性肝损伤作用。

本研究结果显示，与空白组比较，模型组的AST、ALT、TBIL、TG、LDH和ALP活性显著升高。同时病理检查结果显示，肝组织出现明显的病理变化，说明CCl4诱导的急性肝损伤模型造模成功。降糖通脉片预处理小鼠后再给予CC14溶液，结果显示降糖通脉片能够显著降低由CCl4导致升高的AST、ALT、TBIL、TG、LDH和ALP活性，并能显著缓解肝细胞变性坏死和炎性浸润等病理性改变，说明降糖通脉片对CC14诱导的急性肝损伤具有明显的修复作用。同时降糖通脉片不仅能降低肝损伤小鼠的MDA水平，并能恢复甚至提高SOD的活性，且能显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平，提示降糖通脉片很可能是通过抗氧化和抗炎机制来实现其肝损伤修复作用的。

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Repair Function of Jiangtang Tongmai Tablet to the Acute Liver Injury Induced by Carbon Tetrachloride in Mice

SONG Xin-long，LU Bi-nan，SULENG-GAOWA，CHEN Shu，ZHANG Yao-dan，PANG Zong-ran△
(Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Mizu University of China，Beijing 100081，China)

Objective To evaluate the protective effect of Jiang Tang Tong Mai Tablet on carbon tetrachloride(CCL4) induced acute liver injury in mice and its possible mechanism as well．Method:The 40 mice were randomly divided into normal control，model group，JT group，then there is silibinin group(n=10)．The mouse model of acute liver injury was established by injecting 0.2%CCl4，after five days preventive administration．The serum levels of ALT，AST，TBIL，TG，LDH and ALP were determined，and the mice were killed to calculate the index of liver．MDA and SOD were detected in the liver homogenate．Histopathological changes of the liver were observed by HE and Oil red staining．Result JT reduce the liver index in mice insignificantly，decreased the level of ALT，AST，TBIL，TG，LDH and ALP in serum and the content of MDA in the liver homogenate，furthermore increased the activity of SOD in liver tissue．Conclusion:JT could protect the acute liver damage induced by CCL4and its mechanism may be related to the elimination of free radicals and anti-oxidative stress．

JT;Acute Liver Injury;Carbon tetrachloride;Oxidative stress;

R285.5

B

1006-3250(2016)02-0188-03

2015-05-24

国家自然科学基金资助项目(81273921);教育部“长江学者和创新团队发展计划”资助项目(IRT0871);中央民族大学自主科研项目

宋新龙(1985-)，男，河北曲阳人，在读硕士，从事2型糖尿病病机与中医药干预研究。

△通讯作者:庞宗然(1966-)，男，河北承德人，研究员，博士研究生导师，从事糖尿病及其并发症发病机制与中医药干预研究，E-mail:zrpang@163．com。