重度子痫前期胎盘小动脉血管平滑肌细胞BKCa通道的改变*

朱艳,侯晓钰,傅晓冬

（1西南医科大学附属医院产科，四川泸州646000；2陕西省核工业215医院产科；3成都医学院第一附属医院产科）

重度子痫前期胎盘小动脉血管平滑肌细胞BKCa通道的改变*

朱艳1，2,侯晓钰3,傅晓冬1

（1西南医科大学附属医院产科，四川泸州646000；2陕西省核工业215医院产科；3成都医学院第一附属医院产科）

目的：运用膜片钳技术记录重度子痫前期患者胎盘小动脉血管平滑肌细胞上的BKCa通道的活动，探讨重度子痫前期与离子通道间的关系。方法：①收集诊断重度子痫前期患者胎盘10例为实验组，同时收集正常晚孕无妊娠并发症和合并症产妇胎盘10例为对照组；②急性酶分离获得其胎盘小动脉血管平滑肌细胞，用单通道膜片钳软件记录重度子痫前期组和对照组平滑肌细胞BKCa通道的情况。结果：重度子痫前期患者胎盘小动脉血管平滑肌细胞BKCa通道的电流幅值（Amp）为：（4.770 ±1.128）pA；通道的开放概率为（NPO)：（0.006±0.002）；通道的平均开放时间（To）为：（3.991±1.386）ms；通道的平均关闭时间（Tc）为：（791.893±270.693）ms；而正常血压组的Amp为：（7.407±0.881）pA；NPO为：0.021±0.006；To为：（5.764± 0.801）ms；Tc为：（279.330±69.903）ms。两组的比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论：重度子痫前期患者胎盘小动脉血管平滑肌细胞BKCa通道的功能降低，参与了子宫胎盘的缺血缺氧改变，可能与妊娠期高血压疾病的发生发展相关。

重度子痫前期（Sever preeclampsia，SPE）是妊娠期高血压疾病的一类，对母儿的健康危害极大。关于其病因和发病机理尚未完全阐明，比较公认的有：胎盘浅着床、缺血缺氧等学说。

有研究妊娠期高血压疾病患者胎盘小动脉血管平滑肌细胞膜钾电流密度比正常妊娠组减小，静息膜电位比正常妊娠组大。推测妊娠期高血压疾病可能与钾通道功能的改变有关[1]。本实验应用单通道膜片钳记录方式检测重度子痫前期患者胎盘血管平滑肌细胞BKCa通道进行研究。了解在SPE患者BKCa通道的功能是否发生了改变，进行进一步探讨SPE与离子通道间的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2012年6月～2013年2月在泸州医学院附属医院产科确诊为重度子痫前期并终止妊娠的孕妇10例，选取同期在本科室终止妊娠的10例正常孕妇作为对照组。排除既往有炎症性疾病、癌症、严重肝肾功能损害、免疫性疾病、内分泌疾病、吸烟史以及精神或认知异常者。排除多胎妊娠、前置胎盘、胎盘早剥等其他高危妊娠。重度子痫前期并终止妊娠的孕妇10例，年龄20～34岁，血压≥160/110 mmHg，蛋白尿：++～++++孕周：（37.3±4.1）周。正常晚孕组，选取同期在本科室终止妊娠的10例正常孕妇作为对照组，年龄19～34岁，平均血压（124.45± 9.92/80.17±8.27）mmHg；孕周（37.1±3.8）周，各实验组孕龄及孕周之间差异无统计学意义。诊断标准参照乐杰主编第七版《妇产科学》。

1.2 实验试剂及溶液配制

1.2.1 实验试剂

F型胶原酶，木瓜蛋白酶，白蛋白，DTT,HEPES，K-aspartate，和IbTX购自美国Sigma公司，其他为国产试剂。配制单通道膜片钳溶液Ⅰ和溶液Ⅱ，单通道电极液和单通道浴液。

1.2.2 溶液配制

溶液ⅠHEPES10、glucose 12、KCl 5.9、CaCl22.4、NaCl 127、MgCl21.2用于组织及细胞的保存和分离。溶液Ⅱ（mM）HEPES 10、MgCl2 1.2、KCl 5.9、glucose 2。NaCl 127用于细胞的保存和分离。单通道电极液（mM）pH用KOH调至7.20～7.40、EGTA 2、KCl 100、HEPES 10、K-aspartate 40。单通道浴液（mM），pH用KOH调至7.20～7.40、KCl 40、K-aspartate 100、EGTA 1、HEPES 10。酶液，酶Ⅰ(mg/mL)，木瓜蛋白酶1.0，DTT 0.68，白蛋白2.0，用溶液Ⅰ1 ml溶解。酶Ⅱ(mg/mL)，F型胶原酶0.808，用溶液Ⅱ溶解。

1.3 主要实验方法

1.3.1 取材和分离人胎盘小动脉血管平滑肌细胞

经阴道或剖宫产分娩的患者，选取直径约0.3～1 mm的胎盘小动脉血管，顺着血管方向剪下长度约2～3 cm的血管若干。迅速放入温度约为4℃左右的溶液Ⅰ中，立即转送进行试验。在相差显微镜下先剥离周围组织及清洗血管内的血液，急性消化酶消化血管组织获取活性较好的血管平滑肌细胞。

1.3.2 单通道膜片钳技术

将盛有细胞悬液的浴槽放于倒置相差显微镜的操作台面上观察细胞的贴壁情况，选择在视野中央、贴壁稳、细胞膜完整、折光性佳的细胞。在微推进器的帮助下将电极尖端轻轻移向理想的细胞。待电极尖端接近细胞时再使用微推进器使电极尖端轻轻与细胞表面相接触，在示波器上见应答电流下降直至为零，即高阻封接形成(阻抗高达10 GΩ以上)。细胞贴附式膜片形成。电流信号经Clampex 10.1系统专用软件记录并储存于计算机。采样的时间为30 s，频率为1 kHz，方式为Gap Free方式。内面向外式膜片钳的电流。分别记录不同电刺激下胎盘小动脉平滑肌细胞膜上BKCa通道电流信号的变化。

1.3.3 BKCa通道电流记录

在内面向外式膜片钳下记录重度子痫前期孕妇和正常血压孕妇胎盘血管平滑肌细胞BKCa的单通道电流活动，运用inside-out膜片钳记录，在膜电位从0 mV到+60 mV之间的不同的钳制电压下电流幅值和对应的电压数据，制作电流-电压关系曲线(I-V曲线)，Origin 8软件进行I-V曲线的直线拟合，其斜率即为单通道电导值。胎盘小动脉血管平滑肌细胞的电导值为（241.25±20）pS。反转电位接近0 mV。

1.4 单通道电流数据分析和处理

采用Clampex 10.1软件对所获得数据进行数据采集，运用C1ampfit 10.1分析程序进行测量通道的电流幅值（Amp）、开放概率(NPO)、平均开放时间（To）、平均关闭时间（Tc）。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 两步法急性酶分离人胎盘小动脉血管平滑肌细胞

急性酶分离获得的人胎盘小动脉血管平滑肌细胞种类单一，易于分辨，细胞数量多。新分离的平滑肌细胞为长梭形、蚯蚓状，折光性好、胞膜完整、表面光滑。在Ca2+溶液中血管平滑肌细胞在血管收缩剂如（NE，Na，ATP）作用下可见细胞的收缩。图1、图2为分离好的人胎盘小动脉血管平滑肌细胞。分别获得可进行膜片钳检测的平滑肌细胞，研究组和对照组各10例。

图1 低倍镜下（×100）胎盘血管平滑肌细胞

图2 高倍镜下（×400）胎盘血管平滑肌细胞

2.2 人胎盘小动脉血管平滑肌细胞中BKCa通道的鉴别

实验记录到人胎盘小动脉血管平滑肌细胞的单通道电流具有大电导、电压依赖性以及对钙离子浓度的高度依赖性，并可被BKCa特异性阻断剂IbTX阻断的特性。

2.2.1 通道的电压依赖性

在inside-out式膜片钳下，通道的活动呈现明显的电压依赖性。通道的开放呈随机开放的外向电流，随着刺激电压的加大，通道总开放概率（NPO）和通道电流幅值（Amp）显著升高。

2.2.2 通道活动的Ca2+依赖性

在内面向外式单通道膜片钳实验下，分别更换不同钙离子浓度的浴液，其钙离子浓度分别为0M、10－7M、5×10－7M、10－6M时，记录在同样的刺激电位下（+40 mV）,可以观察到在不同的钙离子浓度通道的活动。其总开放概率分别为0.0015±0.005、0.021 ±0.006、0.045±0.008、0.101±0.012。随着钙离子浓度的增加通道总开放概率也增加，表现为钙离子浓度依赖性。

2.2.3 IbTX对BKCa通道的作用

在外面向外式膜片钳下（outside-out）（Vm=+ 30 mV）,浴液中加入200 nM IbTX后，几乎完全阻断了单通道BKCa电流(n=10)

实验记录到人胎盘小动脉血管平滑肌细胞的单通道电流具有大电导、电压依赖性以及对钙离子浓度的高度依赖性，并可被BKCa特异性阻断剂IbTX阻断的特性。上述的电流特性符合大电导钙激活钾通道的单通道电流特性。

2.3 重度子痫前期患者与正常晚孕患者胎盘小动脉血管平滑肌细胞BKCa的比较

实验采用cell-attached膜片钳技术记录，电压钳制在+40 mV下，重度子痫前期组胎盘血管平滑肌细胞的BKCa通道的电流幅值为：（4.770±1.128）pA；开放概率为：（0.006±0.002）；平均开放时间为：（3.991±1.386）ms；平均关闭时间为：（791.893± 270.693）ms。正常组的BKCa通道的电流幅值为：（7.407±0.881）pA；开放概率为：（0.021±0.006）；平均开放时间为：（5.764±0.801）ms；平均关闭时间为：（279.330±69.903）ms。两组的电流幅度、开放概率、平均开放时间、平均关闭时间比较差异有统计学意义（n=10,P＜0.05），(图3，表1)。

图3 在贴附式膜片钳下（Vm=+40 mV），NLP组(A)与SPE组（B）胎盘血管平滑肌细胞BKCa单通道电流对比（n=10）

表1 NLP组与SPE组BKCa单通道电流对比

3 讨论

生理状态下，胞内钙离子超过静息时的浓度，此时由α和β亚基组成的BKCa通道通过其负反馈机制抑制肌细胞的收缩。即是，BKCa通道的活性增加而使膜超极化抑制钙离子从L型钙通道进入，而使肌肉松弛。若BKCa，钙离子内流增加血管平滑肌收缩[2]。BKCa通道不能通过反馈机制产生相应的代偿作用，使血管紧张度升高，促进高血压的产生已有报道[3]目前对高血压的BKCa通道的研究结果还存在差异。有研究自发性高血压大鼠对比正常血压大鼠肾动脉血管平滑肌细胞BKCa通道的活性下降[4]。但liu等[5]在用全细胞膜片钳技术记录自发性高血压大鼠发现其BKCa的电流密度比正常大鼠高，认为这种电流密度的增加是BKCa的负反馈调节血压的具体表现。而其单通道下电导值、钙敏感性、电压依赖性无明显不同。以全细胞膜片钳方式记录高血压组和正常血压组人肠系膜动脉的血管平滑肌细胞上的BKCa电流密度，发现其电流密度，钙离子敏感性显著降低，认为原发性高血压者存在动脉舒张障碍[6]。推测这种差异性可能与不同的种属、不同的组织、高血压发展的不同时期、以及不同的研究方法等相关。

妊娠期高血压疾病患者在胎盘娩出后临床症状逐渐消失。认为在妊娠期高血压疾病状态下滋养细胞侵入子宫螺旋动脉仅仅只达蜕膜层，胎盘植入过浅，子宫螺旋动脉改造欠佳，管径相对狭窄，丧失了低阻力血管的功能，从而导致胎盘血流灌注不足，胎盘缺血、缺氧和代谢障碍，全身小动脉痉挛，尤其在重度子痫前期患者[7]。重度子痫前期存在子宫-胎盘、胎盘-胎儿循环障碍，子宫动脉及脐动脉阻抗增高，胎儿缺氧、胎儿生长受限[8]。

本研究应用单通道膜片钳技术研究显示重度子痫前期组胎盘血管平滑肌细胞BKCa通道的电流幅值、开放概率、平均开放时间较正常妊娠小，而平均关闭时间较正常妊娠长。提示重度子痫前期组胎盘血管平滑肌细胞BKCa通道的功能是降低的。由此认为，BKCa通道的改变参与了重度子痫前期的发生发展过程，也解释了BKCa通道的改变与先兆子痫和子痫患者胎儿宫内缺氧、生长受限具有相关性[9]。

无论在妊娠高血压疾病的胎盘血管平滑肌BKCa通道功能是减弱还是增强，之前的研究都提示BKCa通道功能改变，使血管收缩张力改变，与高血压密切相关。我们可将该课题继续实验下去，增加样本量，并分层统计分析，了解妊娠高血压疾病的胎盘血管BKCa通道功能究竟是减弱还是增强，是否因病情的不同程度，平滑肌BKCa通道功能就不同。进一步，通过药物作用研究胎盘血管平滑肌BKCa通道功能改变，为临床药物治疗妊娠期高血压疾病提供新的治疗靶点以及对药物疗效的检测提供新的方法，或采用全细胞穿孔膜片钳技术研究妊娠期高血压疾病大电导钙激活钾通道的电流密度以及从分子和基因水平研究妊娠期高血压疾病患者胎盘血管平滑肌BKCa通道的遗传差异性。

1.贺同强，苟文丽，李雪蓝.妊娠期高血压疾病钾通道功能的改变[J].中国妇幼健康研究，2007,18（4）：279-281.

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（2016-06-22收稿）

Changes of BKCa in vascular smooth muscle cells of human with severe preeclampsia placental small arteries

Zhu Yan1，2,Hou Xiaoyu3,Fu Xiaodong1
1Department of Obstetrics and Gynecology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan Province,646000;2Department of Obstetrics,Nuclear Industry 215 Hospital of Shanxi;3Department of Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,China

Objective:In this study,we use Patch Clamp technique to record the activities of BKCa channels in VSMCs of patients with SPE,study these changes,then compare with the activities of BKCa in VSMCs of normal pregnant,it is desirable to provide atheoretical basis for the pathogenesis of disease and treatment.Metheds:We selected a control group with 10 patients that met the severe cases of preeclampsia diagnostic criteria,at the same time,choose a normal pregnant group of 10 patients with no pregnancy complications and comorbidities.Keep the enzymatically dissociated VSMCs of human placenta.Clampex 10.1 software and Clampfit 10.1 software were used for data acquisition and data analysis individually.Software were used for data acquisition and data analysis individually.Results:When the test voltage was 40 mV,the Amp of BKCa channels from SPE group was(4.770±1.128)pA，The NPO,To and Tc were 0.006±0.002,(3.991±1.386)ms,and (791.893±270.693)ms individually.However,the Amp,Npo,To and Tc of BKCa channels from control group were(7.407±0.881)pA,0.021±0.006，(5.764±0.801)ms,(279.330±69.903)ms.There were statistical significant difference for Amp,NPo,Tc and Tc（P＜0.05）.Conclusion:BKCa channels in VSMCs of patients with SPE placental small artery were decreased.This could lead to vasoconstriction and increase blood pressure, and involved in the change of utero-placental chemia and hypoxia,which may be associated with the pathogenesis of hypertensive disorders in pregnancy.

Sever preeclampsia;Placental vascular smooth muscle cells;Large conductance calciumactivated potassium channel

R714.24+5

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.05.019

*四川省科技厅项目（2012820178）

朱艳（1979-），女，住院医士，硕士。

傅晓冬（1964-），女，主任医师，硕士。E-mail:dongerfu@163.com

关键词重度子痫前期;胎盘血管平滑肌细胞;大电导钙激活钾通道