丝素纤维表面改性提高细胞粘附性能

余劭婷，秦金桥，关国平，王璐

东华大学纺织学院，纺织面料技术教育部重点实验室(上海，201620)



丝素纤维表面改性提高细胞粘附性能

余劭婷，秦金桥，关国平，王璐

东华大学纺织学院，纺织面料技术教育部重点实验室(上海，201620)

丝素纤维因其良好的力学性能和生物相容性， 在生物材料方面应用广泛， 如医用缝合线、 血管支架等。丝素纤维材料作为血管移植物进入人体后， 细胞粘附往往不能达到预期， 从而引起血栓， 造成失效。该文综述了影响生物材料表面细胞粘附性的因素、 提高丝素纤维材料表面细胞粘附性的改性方法以及细胞在生物材料表面粘附性能的评价方法。期望为进一步拓展丝素纤维在生物材料领域的应用提供参考。

丝素纤维； 细胞粘附； 表面改性

0　引言

丝素纤维是指天然蚕丝经脱胶得到的蛋白质纤维， 因其良好的力学性能和生物相容性[1]， 用于外科手术缝合线已经有很长的历史[2]。随着再生丝素蛋白在生物材料及组织工程支架方面的应用日益广泛[3-5]， 丝素纤维生物材料也越来越引起学者们的兴趣[6-8]。然而， 有研究表明， 丝素纤维材料作为血管移植物进入人体后， 其细胞粘附性能尚不能达到预期[9-10]。因此， 本文分析了影响生物材料表面细胞粘附的因素， 综述了提高丝素纤维材料表面细胞粘附性的方法及评价生物材料表面细胞粘附性能的方法。期望为进一步拓展丝素纤维在生物材料领域的应用提供参考。

1　影响细胞粘附的因素

在移植用生物材料的研究中， 材料表面理化性质是影响细胞粘附能力的重要因素， 通过改变生物材料表面理化性能可以促进细胞粘附[4]。

1.1材料表面形貌结构

材料表面形貌结构(如多孔结构[6]、 纳米结构、 沟槽结构[11])的改变会对所粘附细胞的形态、 材料的比表面积等产生影响， 从而影响细胞的粘附延展、 迁移等行为。

此外， 许多研究发现[9，12]， 粗糙的材料表面的粘附性能要优于光滑的材料表面。表面粗糙度差异也会影响细胞粘附。粗糙度高的表面比表面积大， 可以增大细胞与材料的接触面积。

1.2材料的亲疏水性

通常情况下， 亲水性材料表面更适合细胞的粘附与生长[8]。Wei J等[13]对六甲基二硅醚材料进行氧气等离子体处理， 在样品表面种植纤维原细胞， 结果表明， 亲水性大的表面， 细胞初期阶段粘附的越多。

然而， 当材料亲水性过好时， 往往不利于细胞的粘附[14]。因此， 探究材料表面最适宜的亲疏水平衡状态， 成为众多学者研究的目标。

1.3材料的表面电荷性能

在正常生理酸碱度下， 脊椎动物细胞表面分布着负电荷。通过在材料表面固定带正电基团物质， 如氨基酸[10]， 可以提高材料的表面正电荷浓度， 影响粘附细胞的数量和细胞的粘附力[15]。针对不同种类的细胞， 材料表面电能对其粘附性能的影响有所不同， 即存在细胞特异性[16]。

1.4材料表面大分子基团

生物材料表面的化学功能团对细胞的粘附有着很重要的影响。一般认为， 芳香族等刚性基团不利于细胞粘附， 而-COOH、 -OH、 -NH3、 -NH-及-CONH等有利于细胞的粘附[17]。有学者发现了内皮细胞在不同功能基团表面的粘附性顺序：CH3>NH2>OH>COOH[18]。

多肽具有简单的结构和稳定的性能， 可以固定在材料表面以促进细胞的粘附与增殖。其中， RGD三肽[19]是目前最常用的促细胞粘附肽。此外糖蛋白层连蛋白YIGSR等[20]， CAG三肽[21]， 纤连蛋白类多肽REDV[22]， 多肽也普遍应用在表面修饰中， 促进细胞粘附。

2　 丝素纤维表面改性方法

2.1化学接枝及交联

研究学者通过化学反应将特定的功能基团或大分子接枝到丝素纤维表面， 可以提高细胞的粘附性[23]。例如：Liu 等[24]将磺酸基团接枝到海绵状丝素蛋白复合织物表面， 促进内皮细胞的粘附和增殖。Guan等[25]将肝素和再生丝素蛋白分别接枝到丝素纤维平纹织物表面， 内皮细胞在织物表面粘附性均得到了提高。

通过交联剂、 光、 热作用对丝素材料进行交联， 会对细胞粘附行为产生影响[26]。Wang J等[27]将丝素蛋白溶液经聚(乙二醇)缩水甘油醚(PEG-DE)交联后， 制备管状支架， HUVEC和L929细胞的粘附、 生长情况得到改善。

2.2层层自组装法

层层自组装技术是在带有电荷的基材表面交替吸附聚阳离子物质和聚阴离子物质， 可形成多层膜结构[28-29]， 该技术方便易得， 应用广泛。

Shen 等[30]将带正电荷的海藻酸钠和带负电荷的再生丝素蛋白依次组装到丝素纤维机织物表面。猪髂动脉内皮细胞在自组装后的材料表面的粘附和增殖有所提高。He J X等[31]利用层层自组装的方法制备了一种丝素蛋白/纳米纤维素晶须/壳聚糖支架， 种植人MG-63骨肉瘤细胞后发现， 细胞可以在支架表面粘附， 且生长良好。

2.3等离子体法

等离子可使材料表面产生大量自由基或引入极性基团， 从而使其表面性能得以优化[32]。经等离子体处理后， 丝素纤维的亲水性会得到提高， 从而影响细胞粘附情况。Amornsudthiwat P等[33]用氮气等离子体处理丝素蛋白膜。表面接触角从70°下降到20°， 在样品表面种植L929小鼠成纤维细胞， 发现细胞在丝素蛋白膜表面快速粘附， 且细胞覆盖率高。

等离子体技术可以对丝素纤维进行接枝[34]， Dhyani等[35]利用等离子体在丝素蛋白膜表面接枝pAAc和pHEMA， 提高了材料表面的羧基和羟基含量， Hela细胞粘附、 分化、 铺展情况得到明显改善。

2.4 表面涂层法

表面涂层法操作简单， 适宜于大面积的表面改性， 是一种传统的表面化学修饰途径。目前常用胶原、 脱细胞基质[36]、 羟磷灰石[37]等物质， 涂覆在丝素材料表面， 促进细胞生长粘附。

有学者[38]将丝素蛋白溶液涂覆在丝素基血管材料表面， 发现内皮细胞能够很好地粘附。

2.5生物工程法

生物工程法涵盖基因工程、 细胞工程、 生物反应器工程等多个领域， 通过生物手段来定向改造材料功能。利用基因传递载体， 可以转染蚕的胚胎、 丝腺细胞， 得到特异性表达的蚕丝纤维[39]。Wang等[40]和Kambe Y等[41]培育转基因家蚕， 产出含细胞生长因子的蚕丝。他们的研究结果均表明， 细胞在这类转基因蚕丝材料表面粘附状况良好， 铺展均匀。

众多研究利用细胞生长因子[42]层连蛋白中的TS(8)序列和纤连蛋白的(TGRGDSPAS)(8)序列[43]。ZNF580基因[44]等物质直接结合到， 丝素纤维或丝素材料进行生物改性， 显著改善细胞粘附， 且得到的纤维材料具有功能持久稳定、 无毒性的特点。

3　细胞粘附性能评价方法

目前， 研究细胞与生物材料表面间粘附性的测试方法主要分为两类：一类是通过对粘附界面的形态观测和计数， 来分析细胞的粘附情况； 另一类是通过施加剪切力来评估细胞的粘附力大小， 从而判断细胞粘附情况。

3.1细胞粘附形态及数量评估

通过观察材料表面粘附细胞的数量及形态， 可以得到最直观的结果， 细胞粘附时的形态和融合情况也反映了细胞在材料上的粘附性能。为了探究细胞在样品上的生长粘附情况， 常采用染色的方法对细胞进行标记， 通过显微镜进行观察。如荧光染色法[45]、 MTT法[46]等。

对于结构复杂， 不易于显微镜观测的样品， 通常会对材料进行切片处理。可在一定时间内保留细胞的原貌， 便于观察和保存。在组织切片染色法中， 最基本的方法是苏木素-伊红(HE)染色法[47]。

此外， 通过胰蛋白酶洗脱法， 可使细胞间的蛋白质水解， 粘附在材料表面的细胞会脱落到胰蛋白酶洗脱液中， 经过显微镜观察计数， 可计算出对应的粘附率[48]。

3.2细胞粘附力学性能评估

3.2.1细胞整体粘附力测试

细胞整体粘附力测试通过模拟细胞所处生物力学环境， 对粘附在材料表面的细胞施加剪切力来测试其粘附力大小。测试细胞在受到剪切力作用后， 余留下的细胞数量或面积等数值， 此类方法主要包括：流室法和离心法。

流室(Flow chamber, FC)系统[49]可以在体外模拟血管内血液的流动， 记录剪切力对细胞的作用。根据流室的形状不同， 可分为平行板流室、 圆柱形管状流室和锥形流室[50]等。Yen Kochung 等[51]将人脐静脉内皮细胞种植在角蛋白/丝素蛋白膜表面， 利用动态流动室进行加载， 评估细胞粘附率。

离心法[52]利用细胞离心力与旋转角速度的关系， 根据旋转后圆盘上未脱落的细胞斑的平均半径， 得到细胞的最大粘附力。Kaplan D S等[53]通过离心法测定了软骨细胞及L929细胞在培养板底部的粘附力大小。

3.2.2个体细胞粘附力测试

个体细胞粘附力测试使剪切力直接作用于个体细胞， 测试其在基底材料的粘附力大小。常用方法有：微管吸吮法、 原子力显微镜(AFM)法和光钳法等。

微管吸吮法[54]利用微吸管产生的负压使管壁与细胞接合在一起， 通过显微操作器的水平拉力使细胞与微吸管处于临界脱离状态， 由静力平衡方程获得细胞与材料的切向粘附力。Wang G[55]利用微管吸吮技术， 测定了内皮祖细胞与不同基底材料表面的粘附强度。

原子力显微镜法[56]因其测量精度高， 被广泛运用在细胞粘附力测定中。基于原子力显微镜法， 尹穆楠[57]设计了由光学显微镜和AFM 定位传感控制系统组成的纳米机器人。利用相对的探针将细胞从基底上提起， 可得对应粘附力曲线， 精度达到PN级。

光钳法使用两束激光， 夹持微小物体并进行移动。Andersson[58]利用一种配置有象限探测器和强力激光发射器的光钳装置， 测量了人牙龈成纤维细胞和人成骨细胞在玻璃板、 金属钛和羟基磷灰石表面上的粘附力大小。

整体粘附力测试法无法探究个体细胞的粘附状态(如细胞与基材的接触面积、 细胞的形状等)对粘附力产生的影响； 而个体粘附力测试法缺乏仿生模拟， 使得测试结果与真实情况间存在一定误差。因此， 为了获得更加真实可靠的结果， 在实际应用中， 常将这两类测试方法对比使用。

4　结论与展望

结合生物材料表面性质对细胞粘附性能的影响机理， 对丝素纤维材料表面进行改性， 可改善细胞在丝素纤维材料表面的粘附性能。然而多数改性方法仍存在缺陷， 如化学接枝交联引入化学物质， 等离子体法的时效性限制， 表面涂层易脱落， 生物工程流程复杂且表达蛋白质的浓度和含量低。单一的表面修饰方法往往难以达到实用要求， 改善传统修饰方法， 结合多种改性方法， 有利于制备细胞粘附性优良的丝素纤维材料。细胞粘附性的评价方法很多， 在实际应用中， 需要兼顾细胞形态、 粘附数量、 粘附力等多方面因素， 定性定量的探究细胞在材料表面的粘附情况。

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Surface Modification of Silk Fibroin Fiber for Improving Cell Adhesion

YU Shaoting, QIN Jinqiao, GUAN Guoping, WANG Lu

Key Laboratory of Textile Science & Technology，Ministry of Education,College of Textiles, Donghua University(Shanghai,201620)

Because of the excellent mechanical property and biological compatibility, silk fibroin fiber materials are widely used as biological materials, such as surgical sutures, stents, etc. After implantation of the silk fibroin vascular prosthesis in vivo, the low cells adhesion may cause the formation of thrombus and then lead to failure. In this paper, the factors that affect the cell adhesion on the surface of biomaterials, the methods of improving the surface cell adhesion of silk fibroin fibers and the evaluation methods of cell adhesion on the surface of biomaterials are reviewed, aiming to provide

for the further development of the application of fibroin fiber in the biological materials field.

silk fibroin fiber, cell adhesion, surface modification

10.3969/j.issn.1674-1242.2016.03.007

余劭婷，硕士研究生，研究方向：生物医用纺织品E-mail: yushaoting01@126.com

关国平，副教授，E-mail:ggp@dhu.edu.cn

R318

A

1674-1242(2016)03-0144-06

2016-06-03)