微生物发酵生产莽草酸及其树脂分离性能的探讨

张斌 毛亮亮

（浙江海正药业股份有限公司 浙江台州 318000）

微生物发酵生产莽草酸及其树脂分离性能的探讨

张斌 毛亮亮

（浙江海正药业股份有限公司 浙江台州 318000）

莽草酸是一种具有较高药用价值的化合物，在医药、食品、工业等领域具有重要作用。莽草酸的生产方法很多，包括植物提取法、化学合成法、微生物发酵法等，从植物中提取时使用中草药植物八角茴香，化学合成时以环戊二烯和苯醌为原料，微生物发酵生产时以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等微生物为工程菌。本文就莽草酸的微生物发酵生产方法做简单介绍，阐述了莽草酸树脂分离性能等的研究，并对莽草酸未来发展应用做出展望。

莽草酸 制备 微生物发酵 树脂分离

莽草酸（Shikimic Acid）又名毒八角酸，分子式为C7H10O5，白色晶体粉末。莽草酸及其衍生物在炎症、肿瘤、心血管、禽流感等疾病治疗中发挥重要的作用［1］，从上世纪80年代开始，人们已经开始对莽草酸及其衍生物的作用机理进行研究。随着人们迫切地想研究出治疗这些疾病的方法，莽草酸的需求量越来越大。早期，莽草酸从八角茴香等植物中提取［2］，但随着莽草酸的需求量不断增大，植物提取远远不能满足莽草酸的需求量，再加上植物种植的时间、地域限制和提取方法的繁琐复杂，人们将希望寄托在其它提取方法上。化合成法提取莽草酸的产率和纯度相对植物提取法有着明显的提高，但化学合成法的原始材料来源有限，并且生成的化学废弃物容易污染环境，这也使得该法没有得到广泛应用。微生物发酵法使用生物技术手段，改造生成能够大量生产莽草酸的工程菌，利用微生物发酵培养大量积累莽草酸，由于微生物生长周期短、效率高、成本低、适合大量生产，使得该法广泛应用到社会生产中。

1 莽草酸的制备

莽草酸的制备方法有很多，植物提取法从八角茴香中利用传统工艺提取出莽草酸；化学合成法以环戊二烯和苯醌为原料合成莽草酸；微生物合成法利用生物技术手段改造工程菌株的代谢途径，使其大量积累莽草酸。常用的工程菌株有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等［3］。

1.1 大肠杆菌发酵生产莽草酸

利用基因工程手段调整大肠杆菌工程菌的代谢途径，切断莽草酸生成后进一步代谢的途径，从而使莽草酸大量积累。其原理是大肠杆菌基因中aroK和aroL两个基因分别编码莽草酸激酶Ⅰ和莽草酸激酶Ⅱ［4］，这两个激酶负责莽草酸的进一步代谢，其中莽草酸激酶Ⅱ比莽草酸激酶Ⅰ的Km值小，因此使用基因工程方法敲除大肠杆菌工程菌中的aroL基因，有助于莽草酸的积累［5］。如果将大肠杆菌工程菌中aroK和aroL两个基因全部敲除，将更有利于莽草酸的积累。

1.2 其它微生物菌株发酵生产莽草酸

除了大肠杆菌应用于莽草酸的微生物发酵生产外，枯草芽孢杆菌等也可用于发酵生产。其它工程菌的发酵生产莽草酸方法同大肠杆菌发酵生产方法类似，也是敲除莽草酸激酶编码基因，从而达到积累莽草酸的目的。但在2002年，又出现了新的工程菌构建方法，即诱导并筛选EPSP合成缺陷菌株，从而积累莽草酸和3’-磷酸莽草酸，再加热时3’-磷酸莽草酸又可以转变成莽草酸［6］。

2 莽草酸的纯度测定

紫外可见分光光度法测定微生物发酵产物中的莽草酸含量应用比较广泛，其操作简便，结果准确，成为一种便捷可靠的分析方法。使用该法测量莽草酸浓度之前需要绘制出关于莽草酸的浓度以及对应吸光值的标准曲线，并列出线性回归方程式。标准曲线以莽草酸的浓度为X轴，对应的吸光值为Y轴，线性回归方程的系数R2＞0.99。根据实验总结：莽草酸标准曲线的线性方程为Y=3.0844X-0. 0048，系数R2=0.9999。

将微生物发酵后的产物——发酵液收集起来，取定量发酵液，以12000 r/min转速离心20 min，取上清液，稀释到合适的浓度，用紫外可见分光光度计测稀释后的发酵液在245 nm处的吸光值，吸光值一般不要超过0.6。将吸光值带入标准曲线的线性方程即可得出稀释液的莽草酸浓度。

3 树脂分离性能

生产出莽草酸后，分离纯化是重要问题。常用的分离提纯法有：层析法、萃取法、离子交换树脂法等。其中层析法、萃取法分离效率低，操作繁琐，成本高，溶剂消耗量大［7］；而离子交换树脂法设备简单，操作方便，成本低，可以循环使用。综合各方面原因离子交换树脂法应用更加广泛。常用的树脂有两种：离子交换树脂和大孔吸附树脂，在使用之前两种树脂都需经过预处理。前者树脂交换能力由树脂上活性基团性质决定；后者两分子之间范德华力、氢键和接触面积决定。

测定树脂的分离性能时首先要明确影响吸附性能的外部条件，例如：温度、上液浓度、树脂高度、流速、洗脱液浓度等。设计实验，测定同种树脂在不同外部条件下的吸附性能；再测定不同树脂在同种外部条件下的吸附性能。例如，717阴型离子交换树脂吸附莽草酸时，在一定范围内，温度影响吸附的效果不明显，一般常用吸附温度为24℃；洗脱液乙醇的浓度为95%，洗脱流速为1.4 mL/min，

4 展望

目前实际生产中，微生物发酵法也面临自己的弊端，即工程菌的构建以及发酵液中产物的纯度问题仍有待解决。微生物本身是一个有机生命体，改造工程菌并不是简单的事，切断某一途径很可能对微生物本身造成困扰，扰乱其正常生命机理。因此，通过构建莽草酸工程菌提高产量和纯度的研究仍需努力。随着生物技术的迅猛发展，相信科学家一定能够构建出适宜的工程菌，从而解决社会问题。

［1］孙晓宇，韩丽萍，沈卫荣，等.莽草酸产生菌的筛选及发酵条件初步优化［J］.陕西农业科学，2010，56（5）：33-35.

［2］张军民，傅思武，石晓峰.微生物代谢合成法在莽草酸及其衍生物研究中的应用［J］.中国微生态学杂志，2013，25（1）：91-93.

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1674-2060（2016）02-0177-01