腺相关病毒在耳聋基因治疗上的应用

史珣贝吴南郭维维杨仕明林昶福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所，聋病教育部重点实验室（北京00853）



腺相关病毒在耳聋基因治疗上的应用

史珣贝1吴南2郭维维2杨仕明2林昶1
1福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)
2解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所，聋病教育部重点实验室（北京100853）

【摘要】由于腺相关病毒具有独特的载体优势，越来越多地被应用在基因治疗中。大量文献表明，腺相关病毒可以携带目的基因通过不同手术途径成功导入遗传性耳聋动物模型，在毛细胞，血管纹，支持细胞，螺旋神经节细胞等成功表达，实现形态学和功能学的恢复。本文总结应用腺相关病毒进行耳聋基因治疗的研究进展，突出其优势，总结成功经验及存在问题，为未来腺相关病毒在耳聋中的应用提供新思路。

【关键词】腺相关病毒，遗传性耳聋，基因治疗，载体

Foundation item：The national 973 program of major scientific research program stem cell project(2012CB967900);The national 973 plan major scientific problem oriented project(2011CBA01000);National 863 project young scientists(2014AA020510);National Natural Science foundation of China general project(NSFC #81271082,81400472);National Natural Science foundation of China general project(81470684)；Special Cultivating and Developing Program of Beijing Science and Technology Innovation Base （z151100001615050）.Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

近年来研究表明新出生的1000名婴儿当中，会有1-2个出现先天性耳聋[1]。遗传性非综合征感音神经性耳聋目前尚无有效的药物治疗方法，助听器以及人工耳蜗植入虽然可以帮助大部分耳聋患者获得听力，但恢复程度有限。然而，大部分遗传性非综合征感音神经性都是由于基因纯合隐性突变，单基因突变主要影响毛细胞，支持细胞，血管纹的功能，造成严重的听力丧失[2、3]。目前超过100个耳聋基因已被证实，并且对于耳聋的分子病理学的研究以及诊断耳聋基因突变的能力已经有了大大的提升[4]，所以越来越多的研究者想通过基因治疗实现听功能的恢复。如何选择低毒、高效、靶向性强的载体，协助目的基因进入靶细胞并正确表达，是基因治疗过程中必须解决的难点问题[7]。近20年的临床研究已经证实，腺相关病毒介导的重组基因药物（rAAV基因重组药物）在血友病、癌症、糖尿病、纤维化、癫痫等疾病中具有良好应用前景[8]。目前也有大量文献证实，腺相关病毒可以携带目的基因转染内耳细胞，本文目的阐述腺相关病毒载体在遗传性非综合征感音神经性基因治疗方面的应用。

1　病毒载体在感音神经性耳聋基因治疗中的应用

将目的基因转移至活体总体可分为病毒载体介导的基因转移系统（生物学方法）、非病毒载体介导的基因转移系统（非生物学方法）两大类型[5]。非病毒载体包括脂质体，阳离子聚合物，蛋白多肽等，它们相对安全但是低效。因此，病毒载体应用广泛[9]。研究表明，病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。常用的病毒载体有反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、这几种病毒既可以在离体转染，也可以活体转染。反转录病毒载体、慢病毒载体以及单纯疱疹病毒载体因为感染细胞有限，不能有效转染毛细胞，低表达等原因在感音神经性耳聋基因治疗中不常用[5、6]。腺病毒载体虽然导入效率高，感染性强，也存在成功转染内耳细胞的研究结果，但腺病毒存在局限性，由于不整合宿主基因内，其仅能在细胞内短期存在,故在基因治疗中可能需多次导入腺病毒,这可能会导致对腺病毒产生免疫反应,从而阻止重复感染目的细胞,降低腺病毒载体的有效性,而腺病毒的广泛感染范围,也使其缺乏明显的组织特异[19]。目前被应用在遗传性非综合征感音神经性耳聋基因治疗中最多的病毒载体是腺相关病毒载体。

2　腺相关病毒的转染特性及优势

腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒，是目前所发现的动物病毒中最小的病毒，其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒[5]。病毒颗粒的直径在20 一25nm之间，病毒衣壳一般由3种衣壳蛋白(60一80KD)组成,含有大小在4.7一6kb之间的线性单链DNA基因组[25]。基因组中有3个启动子( P5、P19和P40)和2个开放阅读读框( ORF)，rep和cap。rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52 与Rep40。其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合，Rep52与Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制; cap编码的VP1 ( 90 kDa)、VP2 ( 72kDa)和VP3( 60 kDa)是装配成完整病毒所需的衣壳蛋白，它们在病毒整合、复制和装配中起重要作用[36]。它相对于腺病毒来说具有明显的优势：1.安全性高：是一种非致病性微生物，作为新型安全载体，对人类无致病性；2.免疫原性弱；3.宿主范围广：能感染分裂期和非分裂期细胞；4.物理性质稳定：在56℃的温度下1-2小时感染活性无明显下降，pH值在3-9范围内变动,对AAV的活性没有明显的影响,在4℃条件下可长期保存，在不含特殊成份的普通PBS缓冲液中,活性无明显下降,此外AAV还能以冻干的形式保存,非常便于运输和携带[37]。5.表达稳定：定点整合到靶细胞的染色体上，持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。虽然腺相关病毒可携带5kb以下的目的基因，容量较小，但是大部分目的基因的cDNA片段都在3kb以下。所以腺相关病毒是现在感音神经性耳聋基因治疗的首选载体[5、10-12]。腺相关病毒有多种血清型，不同血清型转染的细胞类型不同，这也与转染方式，启动子等有关[6]。例如AAV2在体外可转染毛细胞及支持细胞[13]，但是通过圆窗膜穿刺方式进入体内只能感染螺旋缘、螺旋神经节及螺旋韧带[14-16]。AAV5无论在体内体外都无法转染毛细胞，但是却可以有效转染螺旋神经节、内沟细胞以及Claudius细胞。Askew C 将AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9携带GFP通过圆窗膜穿刺转入离体新生乳鼠耳蜗毛细胞，实验结果显示这5种血清型都可以成功转染，绿色荧光蛋白可以表达在内外毛细胞，但AAV1对于内外毛细胞的转染效率最高，并且通过圆窗膜注射发现在新生乳鼠体内也可以成功转染[17]。Yunfeng Wang利用AAV2/1、AAV2/7转染新生乳鼠，7天后观察AAV2/1-CMV-GFP转染毛细胞、Hensen’s细胞、Claudius 和OS细胞、血管纹边缘细胞、中间细胞与AAV2/7-CMV-GFP、LV-CMV-GFP相比转染率最高[18]。Omar Akil利用AAV2/1-VGLUT3-GFP通过圆窗膜穿刺转染新生乳鼠，在内毛细胞成功表达VGLUT3[21]。单基因突变主要影响毛细胞，支持细胞，血管纹的功能，造成严重的听力丧失[2][3]，而AAV1在活体中转染毛细胞、支持细胞，血管纹的效率较高，因此AAV1已经成为目前遗传性非综合征感音神经性耳聋基因治疗较为常用的血清型类型。

3　腺相关病毒导入活体动物内耳的方法

根据大量文献显示，目前内耳基因治疗的手术途径主要是鼓阶注射（圆窗膜穿刺）以及中阶注射。圆窗膜穿刺更易用在临床应用上，损伤性较小，但中阶注射在人耳中不易应用在临床上，更多的是在研究膜迷路中基因表达情况中有重要意义。Seiji B.Shibata用圆窗膜穿刺以及中阶注射将BAAV-GFP导入豚鼠进行比较，实验表明在听功能学方面，中阶注射ABR阈值会比鼓阶注射升高的更多，证明中阶注射更易造成听力损失。在形态学方面，病毒载体通过中阶注射会比鼓阶注射有更多的基因表达量[20]。造成人类先天性耳聋Jevell and Lang-Nielsen（JLN）综合征的编码钾通道亚族蛋白的基因Kcnq1表达在血管纹边缘细胞[22]，参与建立内淋巴电位。将AAV1-Kcnq1-GFP用中阶注射和圆窗膜穿刺两种方式导入小鼠，实验表明在形态学方面，中阶注射是唯一一种可以使基因在血管纹边缘细胞成功表达的手术方式，圆窗膜穿刺看不到血管纹细胞有任何表达。在功能学方面，将携带有目的基因Kcnq1的病毒载体用两种方式导入Kcnq1基因敲除小鼠，通过中阶注射可出现ABR有明显改善，但是通过圆窗膜穿刺ABR没有任何的好转[23]。Yunfeng Wang也在文中表示，通过中阶注射可以使血管纹细胞有较高的转染率[18]。这两种注射各有优劣，今后实验可以根据自己的目标细胞来选择导入方式。

4　腺相关病毒进行耳聋基因治疗的实验成果

目前已经有很多的实验利用AAV1成功的将目的基因导入活体动物体内进行基因治疗，在形态学和功能学上都有了明显的好转（见表1）。Vglut3是编码囊泡膜谷氨酸转运体3（VGLUT3）的基因，内耳毛细胞表达VGLUT3，如果缺乏VGLUT3将造成听力丧失[24]。听力丧失是由于内毛细胞释放谷氨酸减少，内毛细胞传入突触的突触传导丧失[26]。利用Vglut3基因敲除小鼠，模拟Vglut3纯合突变模型，利用圆窗膜穿刺鼓阶将AAV1-Vglut3-GFP导入到P0-P12小鼠内耳。在形态学方面，实验结果可见100%在内毛细胞表达。在听功能学方面，导入P0-P12小鼠，7-14天检测，ABR阈值在正常范围内，可以持续至少7周，其中有两只小鼠可以保持1年半。如果在P1-P3导入目的基因可以得到更好的内毛细胞表达，以及更长时间的听力恢复[21]。跨膜类似通道-1（TMC1）突变会造成人类常染色体隐性遗传DFNB7/11和常染色体显性遗传DFNA36。小鼠制成相应模型-Tmc1敲除模型以及Tmc1显性点突变模型，利用圆窗膜穿刺将AAV1-Tmc1-GFP导入到P0-P2小鼠内耳。在形态学方面，实验结果可见大部分在内毛细胞出现基因表达，在顶回极少外毛细胞出现转染。在听功能学方面，ABR阈值不完全恢复，相对于野生型还是有所升高，DPOAE完全没有恢复[17]。Kcnq1基因表达钾通道亚族蛋白，参与内淋巴液钾离子的分泌，建立内淋巴电位[27]。由于Kcnq1只表达在血管纹中间细胞，所以通过中阶导入将AAV1-Kcnq1-GFP导入到Kcnq1-/- P0-P2小鼠体内。在形态学方面，实验结果显示，75±5%表达在底回边缘细胞,71±8%表达在中回边缘细胞，61±10%表达在顶回边缘细胞。在听功能学方面，治疗后的听力ABR阈值可达40dB SPL，虽然比野生型ABR阈值30dB SPL还是高，但是已经较之前未治疗时阈值达到90dB SPL有了很大的改善。听力保护作用可以稳定存在18周，然后以1.4dB/w的速度下降，在30w后治疗组总的ABR阈值增加17dB[23]。流行病学研究表明在基因造成的耳聋中都是由于Gjb2单个基因突变造成。Gjb2编码耳蜗连接蛋白Cx26，在哺乳动物非感觉细胞间起到细胞间耦合作[28-32]。AAV1-Gjb2-GFP通过中阶注射导入Gjb2敲除老鼠的耳蜗中，在形态学方面观察，基因可以在毛细胞、Hensen’s细胞、Claudius细胞、外沟细胞、锤形细胞以及边缘细胞有效表达。在听功能学方面，ABR测定在4KHz-32KHz范围内，治疗组几乎恢复正常[33]。

5　腺相关病毒在进行耳聋基因治疗上存在的问题

腺相关病毒也存在局限性，比如生产病毒的过程繁琐，基因表达有明显的“滞后性”等缺点。总体上rAAV基因重组药物的临床研究仍处于初始阶段，除了免疫原性、安全性外，如何实现转染细胞的靶向性，如何有效调控目的基因的表达，如何提高转染效率、表达效率、基因持久表达、目的基因包装容量，如何解决rAAV基因重组药物的制剂学技术、药代动力学等都是临床应用需要解决的问题[12]。由于在孩童时期，AAV感染较为常见，导致很多人存在AAV获得性免疫，带有AAV中和抗体影响AAV基因治疗的效率，因此目前一种新血清型AAV载体出现--bAAV[6]。除了腺相关病毒的局限性是目前存在的一大问题以外，何时进行基因干预也是亟待解决的问题。对于有学者提出，1.毛细胞纤毛损伤阶段是基因治疗的最好时机，通过完全修复或纤毛再生达到功能的完全或部分恢复；2.内耳毛细胞虽有损伤但没有坏死，支持细胞和神经纤维基本正常，所以有恢复形态和功能的机会，这个阶段导入基因应该有效，是基因治疗的最关键时机；3.毛细胞严重损伤但支持细胞尚存，是毛细胞再生的抢救阶段，而且还

表1　AAV1将目的基因导入活体动物内耳的实验结果Tab.1 Comparison of the experimental results on adeno-associated virus 1 vector transforming target gene into cochlea in vivo

6　未来的发展和展望

目前病毒载体在基因治疗上虽然取得了一些成果，但是仍然存在一些局限性，在恢复效果以及持续时间稳定性等方面不够理想，在未来我们可以尝试将病毒载体基因治疗与人工耳蜗相结合实现功能方面更好的恢复。另外，目前已有众多学者用AAV1携带不同目的基因转染活体动物，已取得了初步的成果，但是所应用的动物模型几乎都是啮齿类动物，比如小鼠或是豚鼠，没有将基因成功转入大型哺乳类动物中。Mitf-M白化耳聋荣昌猪家系是国内发现的首个猪的遗传性听力缺陷家系，也是首个Mitf-M基因突变的大型哺乳动物耳聋模型。猪是医学实验动物中除灵长类以外和人类进化关系最近的物种。猪与人在听觉器官的形态和结构方面具有极高的相似性。因此，猪模型在耳科领域的应用具有较大潜力。在内耳中，MITF特异性表达在血管纹中间细胞中，参与内淋巴电位的形成。在人类，MITF-M基因突变会导致Waardenburg综合征2A型和Tietz综合征，其表现为皮肤、毛发、虹膜着色异常（虹膜异色和早期变灰）以及感音神经性耳聋。我们将来可以利用类似于Mitf-M白化耳聋荣昌猪这种动物模型进行AAV1基因治疗，实现遗传性非综合征感音神经性耳聋基因治疗的另一大突破[35]。

可以争取在Corti器细胞构架没有塌陷之前进行干细胞导入，所以这个阶段内细胞移植可能有效地实现听力恢复；4.Corti器完全失去构架，仅仅残留上皮层或瘢痕化，基因导入完全无效，即使干细胞导入也会面临困难，如何重塑Corti器构架是巨大挑战[34]。因此，应根据不同耳聋基因表达的部位、时间来决定进行基因干预的时间窗。

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·听觉研究新模型专辑·

Application of adeno-associated virus gene vectors in hereditary non-syndromic sensorineural hearing loss

SHI Xunbei1,WU Nan2,GUO Weiwei2,YANG Shiming2,LIN Chang1

1Department of Otolaryngology,First Affiliated Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China 2Department Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Oto-Neurobiology Centre,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

【Abstract】Adeno-associated virus has been used in gene therapies due to its unique gene vector advantages.Large amount of literature has demonstrated successful use of adeno-associated virus carrying various target genes in animal models of hereditary hearing loss with different approaches,to be expressed in hair cells,stria vascularis,support cells,spiral ganglion cells,etc,for the purpose of restoration of morphology and function.This paper summarizes the application of adeno-associated virus gene vectors in hereditary hearing loss,its advantages,successful experiences and problems in the past,and shares new ideas in its utilities in the future.

【key words】adeno-associated virus,hereditary hearing loss,gene therapy,vectors

收稿日期：（2016-01-15）

Corresponding author:LIN ChangEmail:linc301@yahoo.com

通讯作者:林昶，Email:linc301@yahoo.com

作者简介：史珣贝，在读研究生，研究方向:基因治疗与毛细胞再生

基金项目：国家973计划重大科学研究计划干细胞项目（2012CB967900）；国家973计划重大科学问题导向项目（2011CBA01000)；国家863青年科学家项目（2014AA020510）；国家自然科学基金青年项目（面上项目81271082，青年基金81400472）；国家自然科学基金（81470684）；北京科技创新基地培育与发展专项（z151100001615050）；重庆市基本科研业务费项目（11611，14440）

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.008

【中图分类号】R764.43

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）01-37-6