浓香型白酒酿造中的酯化酶研究及应用进展

张楷正，黄　海（.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；.四川省酿酒研究所，四川广汉68000）



浓香型白酒酿造中的酯化酶研究及应用进展

张楷正1，黄海2
（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.四川省酿酒研究所，四川广汉618000）

摘要：酯化酶是浓香型白酒生产上的重要酶类。概述了浓香型白酒生产中酯化酶的研究现状，讨论了酯化酶的反应特性、酯化酶技术在酿酒行业中的应用情况；同时，对当前酯化酶研究中存在的问题及其发展前景进行了讨论与展望。

关键词：浓香型白酒；酯化酶；研究进展

众所周知，白酒中约2％的呈香呈味物质是决定酒体质量的重要物质。在香味物质中，酯类成分是其中的重要组成部分。许多白酒香型的划分就是以主体酯类物质来区别的，如浓香型白酒以己酸乙酯为主体香、清香型白酒以乙酸乙酯为主体香。而酯类物质的合成——酯化，就是酸和醇反应，脱水而生成酯。在微生物体内温和的环境中，此反应需有酯化酶的参与方能顺利完成。

酯化酶不是酶学上的术语。酯化酶亦称羧基酯酶,它是催化合成低级脂肪酸酯的酶类的总称，白酒生产中是指脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶的统称[1]。该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解。因此，白酒行业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶。酵母、霉菌、细菌中均含有酯酶。目前已经发现,红曲霉、根霉中许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力。酯化酶不同于酶学上的脂肪酶，脂肪酶的正式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘油,又能催化脂肪的合成，即脂肪酶是指水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶,而酯化酶则是可以水解羧酯键的酶。

酯化酶的理论基础为酶在有机溶剂中作用，直接将酸与醇催化合成酯类，包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯类物质，在白酒生产中已应用的多为乙酸乙酯合成酶及己酸乙酯合成酶，酯化酶对成品酒的风味同样具有重要的影响。

1　酯化酶的酯化反应特性

酯化酶的反应特性与酯化微生物有关。一般认为，在酿酒微生物中酵母菌合成乙酸乙酯的能力较强；但在对己酸的酯化能力上，不同研究者有不同的看法：栗山一秀认为，酵母的酯化力远远大于曲霉的酯化能力，当酵母与曲霉共同作用时，则己酸乙酯产量大增[2]。“北斗试验组”[3]认为，大曲对己酸的酯化能力优于麸曲，酵母的酯化能力并未表现出优越性，反而不及麸曲，这一点与吴衍庸的研究结果类似[4]。

大曲中的红曲霉、白地霉、根霉和毛霉均具有酯化能力，且相同的酯化酶对不同的有机酸催化成酯的能力也不一样。这完全可以理解，因为从生物化学方面讲，凡是酶，其本质都是蛋白质（除自催化的核糖核酸酶外），在催化化学反应时均存在反应底物及产物、反应温度、反应时间、反应环境的酸碱度和反应介质（反应溶剂类型）等因素的影响而导致产物或者产物生成量的不同。

1.1酯化酶催化的底物及产物种类

酿酒工业中酯化酶对酸底物特异性的研究主要是针对各香型白酒中的四大酯类的合成效果进行研究，主要底物是己酸、乙酸、丁酸和乳酸。

任道群等[5]对红曲霉、大曲以及根霉菌对单一酸（乙酸、己酸、乳酸、丁酸）和混合酸（各酸等比混合）的酯化效果进行了研究，结果表明：红曲霉能促进己酸、丁酸及混合酸与乙醇的酯化作用，生成的酯类物质均为己酸乙酯，而且酯化能力极强；大曲能促进己酸、丁酸及混合酸与乙醇的酯化作用，生成的酯类物质均为己酸乙酯，且能促进乙酸与乙醇的酯化生成乙酸乙酯；根霉能促进己酸和混合酸与乙醇的酯化作用，生成少量的己酸乙酯和乳酸乙酯。实验表明，及时移出反应产物可促进酯化反应继续进行。

杜礼泉等[6]对丰谷酒业保存的1株烟灰色红曲霉酯酶的酯化特性的研究中发现，该红曲霉酯酶对乙酸、丁酸、己酸都有较强的酯化作用,生成相应的乙酯，且红曲霉酯酶是一类专一性很低的酶，属于键专一性的生物酶，在浓香型大曲酒生产中能同时提高四大酯的含量。

唐玉明等[7]在对红曲酯化菌21-3的特性研究中发现，四大酸和乙醇反应生成相应的乙酯，但是四大酸的混合物生成的物质为己酸乙酯。

由于酯化反应的底物为酸和醇类，两者在酯化反应中不仅是底物，还都是酯化酶的变性剂。在低底物浓度范围，己酸乙酯合成转化率是随着底物浓度的增加而增大的，这是因为增加底物浓度，可增加酶分子与底物作用的机会，加快反应速率。在生产实践中，发现一般发酵正常的窖池，产酒多及酸高的，产酯也多，提高了酯化率；但底物浓度过大时，高浓度的酸和醇将影响酶结构的稳定，抑制反应的进行，转化率及总酯含量会下降。

1.2酶促反应温度

温度是所有化学反应中的重要因素。酶促反应中酶能降低底物分子的活化能，在一定范围内提高温度能增加底物分子运动动能，增加底物分子相互碰撞及与酶接触的机会，从而提高反应速度。但是随着温度的升高，一方面酶反应速度加快，另一方面酶蛋白的热变性速度亦加快，因此，一个合适的反应温度对酶促反应的进行有重要意义。

沱牌曲酒厂采取27℃、29℃、31℃、33℃和35℃共5个温度值液态法发酵28 d（酸度4，酒精度9％vol），发现己酸乙酯的合成温度以29℃为宜[8]。一般认为，酯化过程是在发酵后期进行的，即“前缓、中挺、后缓落”的“后缓落”阶段。29℃比较符合浓香型白酒的发酵产酯生香情况。

1.3反应时间和反应介质

一般酯化酶催化的反应，时间长，所得酯类物质相对较高，比如“双轮底”发酵的白酒所含呈香呈味物质就多于普通发酵白酒。2008年，成都邛崃某曲酒厂进行的“双轮底”发酵生产浓香型酒，总酯含量由原来的0.73 g/100 mL提高到1.2 g/100 mL，总酸含量也有相应升高。

反应介质对酯化反应的速率也有较大影响。如在水相中需要100 h的酯化反应，在有机相（正庚烷）中只需24 h就能完成。与水相催化相比,有机介质可以增加酯化酶的热稳定性,增加非极性底物的溶解度,减少反应副产物,还可能影响酶的底物特异性及酶反应的平衡方向和反应速度。有机溶剂相中酯化反应平衡点与反应速率同溶剂中水含量密切相关,有机溶剂作为反应介质时,在一个狭窄的初始含水量范围内,酶有较高的催化酯化活力[9]。但在食品工业中，有机相溶剂的存在不利于简化下游操作步骤，并存在有机溶剂污染食品问题。水相酯化反应虽然进行缓慢，但可以和实际生产相结合，可将酯化产品直接应用到生产中，简单方便。所以应该根据不同目的，选用不同反应介质来进行酯化反应。

1.4反应环境的酸碱度

酯化反应的酸碱度或者反应的pH值对产酯效果影响较为显著，一般应在较高酸度即较低的pH值下进行，大多数窖内或缸内发酵环境基本可满足条件。以己酸乙酯合成为例，沱牌酒厂选取了2.5、3.0、3.5、4.0、4.5共5个不同酸度，在酒精度5％vol、温度25℃时液态法发酵28 d，结果表明，己酸菌生长适宜酸度为3.0以下，而适宜的酯化酸度为4.0。

2　浓香型白酒酿造中应用的酯化酶技术

酯化酶技术的应用是中国白酒工业的一项重大创新成果，在白酒生产中应用的酯化酶制剂是生物酶和活菌体的生态混合体，在发酵过程既有传统大曲的糖化功能，也有生香功能，从而可缩短发酵周期，提高出酒率和优品率[10]。

2.1酯化液串蒸

酯化液是将25％～30％的优质新鲜黄水和65％～70％的酒尾（10％vol～20％vol），再加入约2％的大曲粉、3％的酯化酶制剂、适量窖泥或窖泥培养液及底糟，倒入坛内，混匀，保温发酵40 d，让其进行缓慢酯化反应，即成酯化液粗品。

表1　酯化液串蒸酒体主要指标变化　(g/100mL)

酯化液粗品可以直接混入底锅或撒至粮糟上进行串蒸，效果较好。李大和[11]试验的酯化液串蒸效果见表1。

2.2酯化液灌窖

具体操作措施：将发酵成熟的酯化液粗品，在窖池主发酵结束后泼入加粮的酒醅中，再密封发酵60 d，出窖蒸馏。一般总酯含量可提高30％～50％。需要选择窖泥质量好、不渗水的窖池，一般每甑灌入50 kg酯化液即可。同时注意，温度较高的夏季不宜灌窖。

2.3高酯调味酒（液）的应用

将酯化液粗品进行三级过滤，最后精滤得到无色透明的高酯调味酒，或者将酯化液粗品注入分馏器，收集酒精含量60％vol以上的馏出液，可得香味浓郁的、己酸乙酯含量高达4～6 g/L的高酯调味酒，用于中、低档成品酒的勾调，可使普通白酒向优质酒转化。甘肃泷西渭水酒业集团2003年引进酯化酶技术生产酯香液，用于中低档成品酒的勾调，效果明显好于外购香料[12]；吴衍庸[13]等开发的多功能复合香酯酶技术，在河南仰韶酒上应用，使用1 t由香酯酶生产的香酯液，可多出优质酒10 t。

2.4利用酯化酶制剂提高出酒率及优质品率

将酯化酶用于双轮底发酵和回沙撒糟醅，可以较大地提高浓香型白酒中的总酯含量和优质品率，同时可以提高出酒率。王述荣等[14]研制的粗酶制剂YH-AM用于洋河大曲酒的生产，结果提高出酒率7.21％，提高优质酒率19.55％。信春晖等[15]在扳倒井大曲酒生产中添加复合酯化酶，平均出酒率提高6.7％，优质酒率提高7.3％；贾超英等[16]在泰山特曲生产中添加复合酯化酶，使优质酒率提高6.1％；王晓丹等[17]利用酯化红曲霉FBKL 3.0018制成的酯化酶粗酶制剂，加入到浓香型清酒发酵中（1.5％），用曲量减少了2％～5％，出酒率提高了约2％；从微量成分含量分析，酒品质量明显提高（表2）。

樊琪[18]在山东3株阁老贡酒生产中添加复合酯化酶，使出酒率提高5％，优质酒率为41.2％；束成忠等[19]研究为第1轮发酵后的优质酒率提高16.5％，第2轮发酵后的优质酒率提高6.2％。武建国等[20]以香醅为载体，加入红曲酯化酶等材料，提高优质酒率7.2％～14％，己酸乙酯增幅在124.8～162.5mg/100 mL。

3　当前酯化酶研究中存在的问题与展望

酯化酶应用技术在浓香型白酒生产中极大地提高了优质酒的比例，同时也使出酒率得到提高；突出了浓香型白酒己酸乙酯的主体香，同时又使几大酯的比例协调，窖香浓郁，酒体丰满，醇和爽净。虽然酯化酶技术渐趋成熟，但当前酯化酶研究中尚存在以下一些问题：

表2　添加酯化酶制剂及减曲的效果分析　（g/L）

（1）产酯微生物的选育仍需加强。尚需选育出适应性强、不易变异、酯香风格特点更为突出的菌株，包括酵母菌、霉菌等真菌。

（2）酯化酶的酶活及纯度需要提高。酯化酶制剂大部分还停留在粗酶制剂阶段，纯度不高。今后应从提高酶纯度入手，生产出商品酯化酶，形成一定的产业化规模，可满足广大酿酒企业的需要，提高优质酒的占比。

（3）在产酯能力提高的同时，应注意加大对白酒蒸馏环节提香作用的研究，使酒醅中酯香类物质得到较为充分的提取。

（4）在过滤蒸馏出合格的高酯调味酒后，酯化液中剩余的固形物，有待加强研究利用；同时应进一步研究酯化酶在水相中催化分解脂肪成甘油和高级脂肪酸，再形成高级脂肪酸酯的过程，以期达到对曲酒风味更为详尽的解析。

4　结束语

酯化酶是浓香型白酒生产中的重要酶类，酶量的多少和酶活的高低，与白酒的优质品率密切相关。生产中采取多种方法并合理利用，可以提高出酒率和产品质量。当前应加大酯化酶催化过程的研究，选育风格特点突出的产酶微生物，提高酶制剂的纯度及进行蒸馏提香过程的研究。

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Research Progress in and Application of Esterifying Enzyme in the Production of Nongxiang Baijiu

ZHANG Kaizheng1and HUANG Hai2
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong,Sichuan 643000;2.Sichuan Provincial Liquor-making Research Institute,Guanghan,Sichuan 618000,China)

Abstract:Esterifying enzyme plays an important role in the production of Nongxiang Baijiu.In this paper,the present research situations of esterifying enzyme were reviewed,including its reaction properties and its application in the production of Nongxiang Baijiu.Meanwhile,the prospects and the problems of esterifying enzyme in the research and in the application were discussed.

Key words:Nongxiang Baijiu;esterifying enzyme;research progress

作者简介：张楷正（1969-），男，四川富顺人，博士，副教授，主要从事发酵工程研究，E-mail：kai7766@126.com。

收稿日期：2015-07-27

基金项目：四川理工学院人才引进项目（2014RC26），泸州老窖科研奖学金项目（13ljzk08），四川理工学院教改项目（JG-1527），四川理工学院大学生创新创业训练计划项目（201410622026）。

中图分类号：TS262.3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）02-0093-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015322

优先数字出版时间：2015-10-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151023.1400.004.html。