洋河微分子酒健康功能活性物质研究

王　丽，王　笛，俞心愉，代家勇，李　磊（南京医科大学公共卫生学院，江苏南京211100）



洋河微分子酒健康功能活性物质研究

王丽，王笛，俞心愉，代家勇，李磊
（南京医科大学公共卫生学院，江苏南京211100）

摘要：利用高分辨质谱联用技术，探索洋河微分子酒中存在的微量功能活性物质。微分子酒样品经顶空固相微萃取和低温水浴蒸发浓缩处理后，采用气相色谱-质谱及高分辨超高效液相色谱-质谱联用技术进行检测。经SIEVE提取、NIST和HMDB库搜索、匹配，初步筛查解析出近2000种微量物质。这些微量物质中，发现460多种特定功能性微分子，如核苷类似物、圣草酚、4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸等。微分子酒中存在的多种功能活性物质，丰富了绵柔型白酒的内含，顺应了“健康饮酒，饮酒健康”的新型理念。

关键词：微分子酒；功能活性物质；白酒

2014年8月，洋河股份有限公司隆重推出了一款全新产品——微分子酒。微分子酒是洋河利用5年时间专门研发的一款全新健康白酒产品，它采用固态双边发酵工艺及平衡酒体风格的精湛勾兑技术，目标在于使酒体中的分子变小，赋予其不上头、醒酒快，且含有多种活性微量成分，酒质既丰满绵柔，又多饮不醉的特点。

本研究利用质谱联用技术，研究微分子酒中的微量物质、寻找其中的生物活性物质，为饮酒健康提供相关的基础数据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

样品：洋河微分子酒。

气相色谱质谱仪（TSQ 8000，美国Thermo）；超高压液相色谱（UPLC）和质谱仪（Q-Exactive，美国Thermo）；TG-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25µm，美国Thermo）；数控型磁力加热搅拌器；20 mL螺纹顶空萃取瓶及配套螺纹铝盖和聚四氟乙烯垫（美国Agilent）；SPME手动进样手柄及50µm DVB/CAR/PDMS（美国Supelco）。

1.2实验方法

1.2.1气相色谱质谱检测

采用顶空固相微萃取，萃取条件为：取7 mL稀释至15％vol酒精度的白酒样品、2 g氯化钠（马弗炉烘烤）和一粒搅拌子置于20 mL顶空瓶中，以DVB/CAR/PDMS萃取纤维在45℃恒温条件培养5 min，以1500 r/min转速搅拌萃取20 min后，迅速将萃取纤维插入气质联用仪的进样口中以220℃解吸3min测定。气相参数：进样口温度220℃；不分流进样（不加玻璃棉）；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；程序升温，35℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到220℃保留2 min。质谱参数：传输线温度为250℃，EI源，温度230℃。电子轰击能量为70 eV，发射电流为100 μA，预四级杆电压为-7.8 V，采用全扫描模式，扫描范围35～500 m/z。

在上述萃取过的酒样基础上，再以DVB/CAR/PDMS萃取纤维在80℃恒温条件培养5 min，以1500 r/min转速搅拌萃取30 min后，迅速将萃取纤维插入气质联用仪的进样口中于220℃解吸3 min测定。气相参数：进样口温度220℃；不分流进样（不加玻璃棉）；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；程序升温，70℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到230℃保留2 min。质谱参数：同上。

1.2.2液相色谱质谱检测

样品处理：取500 mL酒样置于蒸发皿中，50℃水浴蒸干后，用乙醇-水溶液500 μL复溶，溶液转移至棕色样品瓶待测。同时用45％vol乙醇溶液500 mL水浴蒸发做程序空白，检测结果扣除空白值。液质检测参数：液相参数，Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱；流动相为0.1％甲酸水(A)和0.1％甲酸乙腈(B)；采用梯度洗脱（表1）；流速0.3 mL/min；进样盘温度4℃；进样量5 μL；柱温40℃。梯度洗脱为5％ B（0～5min），5％～95％ B（5～15 min），95％ B（15～20min），5％～95％ B（20～21 min），5％ B（21～23 min）。质谱参数，鞘气流量为50 mL/min；辅助气流量为13 mL/min；毛细管温度为300℃；ESI源；扫描范围正、负离子模式均为100～1050 m/z。一级扫描分辨率为70000。

1.3数据处理

气相色谱质谱数据根据色谱峰对应的质谱图进行NIST库搜索匹配；液相色谱质谱数据根据采集的图谱，利用SIEVE软件进行精确分子量提取，所得精确分子量再进行HMDB库搜索匹配，正离子模式质量精度小于5mg/L、负离子模式质量精度小于10mg/L纳入统计范围，筛选出的部分物质最终经标准对照确认。

2　结果与分析

2.1洋河微分子酒质谱全扫图

分别采用气相色谱质谱（GC/MS）和高分辨串联液相质谱(UPLC/Q-obitrap)探索洋河微分子酒中的功能活性物质。在质谱检测基础上结合相关软件和标准谱库，共定性出4683种微量物质，其中气味微量物质166种（其中，28种属于特定功能性微分子），滋味微量物质4517种（其中，432种属于特定功能性微分子）。图1（A,B,C,D）展示了质谱检测的峰响应信号，可以看出洋河微分子酒中蕴含了大量的微量物质，其中有许多微量物质具有生物活性，这些活性物质在酒中的存在不一定说明酒本身具有某种生理功能，但这些成分可能在减弱酒精对人体损伤方面有辅助作用，有益于人体健康。

2.2洋河微分子酒中核苷类活性物质

图1　洋河微分子酒质谱全扫图

经标准物质对照和UPLC/MS检测，洋河微分子酒中发现有核苷类似物。微分子酒中核苷类似物的生成与核苷功能菌的生长代谢有关。酿酒工艺过程中，通过优化原料配比结构和调整工艺参数，为酵母等酿酒微生物提供生长繁殖与代谢的同时，也为核苷功能菌提供相对合适的培养载体，通过核苷曲的形式在发酵前期利用酒醅中保留的氧气实现增殖与代谢，产生核苷类似物。研究表明，核苷类似物能抵抗酒精氧化性肝损伤，对肠粘膜免疫屏障功能损伤发挥保护作用。核苷类似物可以增加白细胞介素-10和增强白细胞介素-10的mRNA的表达，同时可以减少白细胞介素-2的产生、减少外周血单核细胞的增殖等作用[1]。不同浓度的核苷类似物对HepG-2有明显抑制作用，且呈剂量依赖性[2]。核苷类似物抗白血病与其抑制白血病细胞中末端脱氧核苷酸转移酶的活性有关。最新研究证实，核苷类似物诱导的DNA损伤引发了细胞周期阻滞和凋亡，导致了白血病NB-4 和U937细胞生长抑制。

2.3洋河微分子酒中有机酸类活性物质

洋河微分子酒中除含有白酒中常见的乙酸、L-乳酸外，还含有组氨酸、亚油酸、甲酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、2,3-二羟基-4-(9-腺嘌呤)丁酸、十八碳四烯酸、香豆素-3-羧酸、4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸、齐墩果酸等有机酸。乙酸、乳酸等低分子有机酸具有杀菌抗病毒功能，乙酸具有扩张血管、延缓血管硬化的功能。L-乳酸是人体必需的有机酸，能促进双歧杆菌生长从而使体内微生态保持平衡。组氨酸是人体半必需营养物质。亚油酸是人体必需脂肪酸，它具有预防胆固醇过高、改善高血压、预防心肌梗死、预防胆固醇造成的胆结石和动脉硬化等作用。甲酪氨酸为新发现的具有辅助降低血管压力的物质。该物质可能是微分子酒的健康功能因子。3-羟基-L-酪氨酸本身为体内合成去甲肾上腺素、多巴胺等的前体物质之一，属儿茶酚胺，具有治疗震颤麻痹的功效。2,3-二羟基-4-(9-腺嘌呤)丁酸是由腺嘌呤上接一个丁酸组成的一种腺嘌呤衍生物，因为该物质在香菇中被发现，也称其香菇嘌呤。研究表明，2,3-二羟基-4-(9-腺嘌呤)丁酸降血脂作用比常用降血脂药安妥明强10倍，且口服有效。同时具有降低血浆中高半胱氨酸浓度的作用，从而可以防治高半胱氨酸浓度过高引发的血栓和血管疾病。其作用机制是通过调控脂肪酸代谢及改变磷脂酰胆碱分子谱图的组成，来降低血液胆固醇的含量。在谷物发酵后蒸馏生产的微分子酒中发现2,3-二羟基-4-(9-腺嘌呤)丁酸具有重要的健康意义。十八碳四烯酸是人体必需的典型多不饱和脂肪酸。香豆素-3-羧酸是一种具有较强抗氧化作用，且具有呈香作用的物质。4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸为咖啡酸反式异构体，具有重要抗氧化损伤作用。齐墩果酸具有香辣气味，除了具有抗氧化损伤作用外，还有镇静的功能。此外，微分子酒中还含有多种氨基酸，为人体健康提供营养。

图2　核苷类似物色谱图（a）及质谱图（b）

2.4洋河微分子酒中酚类活性物质

酚类物质为优良的自由基清除剂，具有抗氧化、清除活性氧自由基、抗肿瘤等功能。洋河微分子酒中含有多种酚类物质，如圣草酚、儿茶酚、愈创木酚、麝香草酚等。其中的圣草酚对酒精氧化损伤有特殊的保护作用。具有抑制AAPH诱导牛血清白蛋白BSA蛋白羰基化的能力，具有抑制AAPH诱导肝匀浆MDA的生成能力，具有抑制HepG2癌细胞活性的能力，具有抑制AAPH诱导pBR322DNA氧化损伤的能力等[3]。

2.5洋河微分子酒中酯类活性物质

洋河微分子酒中除含有乙酯类，如乙酸乙酯、己酯乙酯、乳酸乙酯、亚油酸乙酯等外，还含有一些内酯类物质，如山莴苣素等。乙酸乙酯对乙醛有制约作用，可通过肾调动体液来排除酒中对人体不适反应的物质，加速人体新陈代谢。己酸乙酯具有降肺火、稳定心肺的功能。乳酸乙酯有促进乙醇刺激大脑皮层使人体产生兴奋的作用。同时乙酸乙酯、乳酸乙酯又会水解或酶解成乙酸、乳酸等小分子有机酸，起到扩张血管的作用。酒中的亚油酸乙酯等酯类物质进入人体后又水解为多不饱和脂肪酸，达到抑制胆固醇合成的作用。山莴苣素又称莴苣苦内酯，具有镇咳、镇静作用，此外还显示较强的细胞毒作用，具有抗癌活性。

2.6洋河微分子酒中吡嗪类活性物质

洋河微分子酒中检测出了8种以上微量吡嗪类物质，如四甲基吡嗪等。研究表明，酒中的吡嗪主要由“美拉德反应”、微生物的代谢产物、蛋白质和氨基酸的加热分解产生。吡嗪是构成酒类风味的重要成分之一。相关报道显示，四甲基吡嗪具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板积聚的作用[4-5]，赋予了白酒健康的功能。

2.7洋河微分子酒中其他活性物质

洋河微分子酒中存在微量的烟酰胺核糖，为维生素B3的一种衍生物。对这种物质功能的研究主要集中在两个方面，一是在牛奶中发现天然存在的烟酰胺核糖，该物质能帮助对抗肥胖，其作用方式可能是直接靶向SIRT1，就像红葡萄酒中的成分白藜芦醇一样，也可能通过提高SIRT1粘附分子，辅因子NAD+的表达水平；另一方面，科学家们最近发现，通过饮食补充烟酰胺核糖，能够提高细胞内的NAD+水平，从而阻止小鼠肝癌的发展，诱使肿瘤退缩。本研究在滋味微分子中发现了烟酰胺核糖，对于说明微分子酒的生物功能具有重要意义。

微分子酒中发现了微量的倍他洛尔，该物质有调整血压的作用，尤其对中度高血压和无严重并发症的年轻高血压患者效果最佳。也适用于治疗开角型青光眼和眼高压。对解释微分子酒的舒压作用具有重要参考。

微分子酒中的洛伐他汀，原为红曲中发现的成分，可通过抑制HMG-CoA还原酶，抑制内源性TC合成，肝内胆固醇减少，可使肝细胞表面的LDL受体增加，血液中的LDL-C被肝细胞摄取增多，从而使血浆TC下降，TG、LDL-C浓度亦降低，HDL-C升高。对高胆固醇血症、原发性高胆固醇血症、Ⅲ型高脂蛋白血症以及糖尿病性、肾性高脂蛋白血症有效[6]。微分子酒中洛伐他汀的发现是否与其生物功能相关，有待进一步研究说明。

微分子酒中发现的熊果苷物质能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑[7]，同时还有杀菌、消炎的作用。

微分子酒中发现的2-氨基-6-羟基嘌呤属嘌呤类有机化合物，是重要的生命物质，能抵抗免疫受损。此外，微分子酒中还存在多元醇类、呋喃类、萜烯类等一些具有生物活性的物质。从质谱检测所响应的大量信号来看，洋河微分子酒中蕴含的其他许多生物活性物质还有待进一步探索、发掘。

3　结论

通过质谱联用技术对洋河微分子酒中功能活性物质进行探索研究，初步发现含有核苷类似物、组氨酸、圣草酚、4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸等460多种活性物质。这些功能物质的存在，单独或协同发挥作用，以抵抗机体的氧化损伤，赋予了微分子酒一定的健康功能。质谱检测发现微分子酒中含有大量微量物质，其中蕴含的许多生物活性物质有待进一步发掘、确认。

参考文献：

[1]Zhou X X，Meyer C U，Schmidtke P，et al.Effect of cordycepin on interleukin-10 production of human peripheral blood mononuclear cells[J].Eur J Pharmacol，2002，453(2-3)：309-317.

[2]丁向萍，马力，魏书堂，等.核苷类似物诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对端粒酶活性影响的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2008,15(2)：109-113.

[3]张亦凡，刘功关，刘茜，等.圣草酚抑制自由基诱导的生物大分子损伤及对肝癌细胞HepG2毒性的作用[J].食品科学,2013,34(17)：126-130.

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[7]秦良，刘有停，陈毅明，等.α-熊果苷对酪氨酸酶二酚酶激活动力学的研究[J].化学研究与应用,2014,26(11)：1798-1801.

Functional Active Substances in Yanghe Micro-molecular Liquor

WANG Li,WANG Di,YU Xinyu,DAI Jiayong and LI Lei
(School of Public Health,Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu 211100,China)

Abstract:Hyphenated mass spectrometry was applied to explore the functional active substances in Yanghe micro-molecular liquor.Fristly,liquor samples were processed by SPME and low-temperature water bath evaporation,and then detected by GC/MS and UPLC/MS (high resolution).About two thousand functional active substances were screened out by SIEVE extraction,and NIST and HMDB searching and matching.Among these functional substances,460 kinds had specific functions including cordycepin,saint grass phenol,and 4-hydroxy-3,5-dimethoxy cinnamic acid etc.The existence of multiple functional substances in micro-molecular liquor could enrich the features of soft-type Baijiu,which met the new concept of healthy drinking.

Key words:micro-molecular liquor;functional active substance;Baijiu

作者简介：王丽(1985-)，女，硕士，实验师，研究方向为营养与食品卫生。

收稿日期：2015-11-25

中图分类号：TS262.3；TS261.4；TS971

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）02-0125-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015445

优先数字出版时间：2016-01-21；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160121.0910.001.html。