KRAS、BRAF基因突变在大肠锯齿状病变中的临床应用

李艳菊　陈　荣　张春莉　惠起源

716000 延安大学附属医院(李艳菊，张春莉，惠起源)；716000 延安市中医院(陈　荣)



·基础研究·

KRAS、BRAF基因突变在大肠锯齿状病变中的临床应用

李艳菊陈荣张春莉惠起源

716000 延安大学附属医院(李艳菊，张春莉，惠起源)；716000 延安市中医院(陈荣)

【摘要】目的研究KRAS、BRAF基因突变在大肠锯齿状病变中的临床应用。方法选取100例大肠锯齿状病例经切除术后的石蜡标本进行研究。应用直接测序技术对KRAS、BRAF基因的突变进行检测分析。结果大肠锯齿状病变中KRAS基因突变率为40.00%，BRAF基因突变率为6.67%。所有大肠锯齿状病变患者中有40例检出KRAS基因突变，突变率为40.00%，其中KRAS基因12、13密码子突变率分别为30.00%以及10.00%。KRAS 基因突变率与患者性别、年龄、病变部位、分化程度以及淋巴结转移等临床病理特征均无关(P>0.05)。 BRAF基因突变在>65岁患者以及大肠近端情况较多见(P<0.05)。结论随着KRAS、BRAF基因突变的研究不断深入，对指导临床进行随访及药物治疗预后的判定具有重要的临床意义。

【关键词】KRAS；BRAF；基因突变；大肠锯齿状病变

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:523～525)

大肠癌是全世界最为多见的恶性肿瘤之一，而锯齿状腺瘤可能跟传统的腺瘤(管状、绒毛状和管状绒毛状) 等各种类型的癌前状态有关，因而近几年来不断被密切关注[1-2]。锯齿状肿瘤已经成为WHO(2010)关于消化系统肿瘤分类的重点之一[3]。本文特此研究KRAS、BRAF基因突变在大肠锯齿状病变中的临床应用，得到了一些结论，现报告如下。

1材料与方法

1.1临床资料

从2012年6月至2014年6月，选取我院100例大肠锯齿状病例经切除术后的石蜡标本进行研究。所有患者均经过HE染色病理组织学得以确诊，其中男性患者64例，女性患者36例，年龄45～76岁，平均年龄为(46.3±4.3)岁。将所有标本使用甲醛进行固定，用石蜡将组织包埋。对全部患者做KRAS基因第2号外显子突变检测，其中45例患者检测其BRAF基因的第15号外显子突变情况。

1.2研究方法

实施基因组DNA的提取：使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒对组织的DNA进行提取，行4 μm厚的5~10张切片，实施脱蜡以及水化处理。PCR方式对KRAS基因第2号外显子以及BRAF基因的第15号外显子进行扩增处理：根据KRAS、BRAF基因组DNA序列设计PCR引物，序列为：KRAS基因第2号外显子：上游段引物为5’-AGGCCTGCTGAAA—ATGACTG-3’，下游段引物为5’-GGTGCAGGACCATF—CTTTGA-3’，目的片段173 bp；BRAF基因的第15号外显子：上游段引物为5’-GCTFGCTCTGATAGGAAAATGAG-3’，下游段引物为5’-GTAACTcAGCAGcATCTCAGG-3’，目的片段为237 bp；以β-actin基因作为对照组，检测所提取的组织DNA质量。β-actin基因的引物：上游段引物为5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游段引物为5’-GGTCTTGCGGATGTCCAC-3’，目的片段为492 bp。PCR反应体系为25 μl，其反应条件是：在94 ℃条件下预变性10 min，之后变形45 s，72 ℃下进行延伸45 s，一共进行40个循环，之后在72 ℃下延伸7 min，在4 ℃时结束。将双蒸水替代DNA模板做阴性对照，提取PCR的扩增产物5 μl，使用2%的琼脂凝胶进行电泳处理，使用溴乙啶进行染色处理。DNA测序：将PCR的产物直接进行纯化处理，应用美国ABI3730XL测序仪，用双脱氧核糖核酸链末端终止方式对PCR的产物进行DNA测序。

1.3观察指标

分析大肠锯齿状病变中KRAS、BRAF基因突变类型分布情况以及KRAS、BRAF基因突变与大肠锯齿状病变患者临床病理特征的关系。

1.4统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件分析，数据比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大肠锯齿状病变中KRAS、BRAF基因突变类型分布情况

大肠锯齿状病变中KRAS基因突变率为40.00%，BRAF基因突变率为6.67%，见表1。

2.2大肠锯齿状病变中KRAS基因突变类型和发生率

所有大肠锯齿状病变患者中有40例检出KRAS基因突变，突变率为40.00%，其中KRAS基因12、13密码子突变率分别为30.00%及10.00%，见表2。

2.3KRAS、BRAF基因突变与大肠锯齿状病变患者临床病理特征的关系

KRAS 基因突变率与患者性别和年龄，病变部位，分化程度以及淋巴结转移等临床病理特征均无明显联系(P>0.05)，BRAF 基因突变在>65岁患者以及大肠近端情况较多见(P<0.05)。见表3。

表1　大肠锯齿状病变中KRAS、BRAF基因突变类型分布情况

表2　大肠锯齿状病变中KRAS基因突变类型和发生率

3讨论

锯齿状腺瘤既有增生性息肉的结构特征又有腺瘤性息肉的细胞学特点，在低倍镜下观察其组织病理学表现时可发现既有增生性息肉样的锯齿状腺体，又有上皮的异型增生，而内镜下锯齿状腺瘤的形态与增生性息肉相似，因此以往锯齿状腺瘤经常被诊断为增生性息肉或腺瘤性息肉[4]。

据统计，锯齿状腺瘤发生在近端结肠(盲肠、升结肠和横结肠)的比例达35.14%,而增生性息肉和传统腺瘤在这些部位的发生比例明显低于锯齿状腺瘤。增生性息肉以及锯齿状腺瘤在直肠和乙状结肠发生率均较大，说明直肠以及乙状结肠的锯齿状腺瘤极有可能来源于此部位的增生性息肉。然而近端结肠的锯齿状腺瘤所占比例明显大于增生性息肉，说明该处的锯齿状腺瘤很有可能来源于其他的病灶[5]。微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)和CpG岛甲基化，KRAS以及BRAF基因突变是锯齿状病变研究中最受关注的分子遗传学改变，并且在这3方面均与结直肠癌存在一致性[6]。微卫星不稳定、CpG 岛甲基化在锯齿状肿瘤与腺癌的相关性研究已经得到证实。但是KRAS、BRAF基因突变率在增生性息肉与锯齿状腺瘤比例不一，本研究显示，大肠锯齿状病变中KRAS基因突变率为40.00%，BRAF基因突变率为6.67%。所有大肠锯齿状病变患者中有40例检出KRAS基因突变，突变几率为40.00%，其中KRAS基因12、13密码子突变几率是30.00%以及10.00%。这可能和以下3个因素有关：①大体形态：隆起型锯齿状腺瘤KRAS基因突变率较高，扁平型锯齿状腺瘤的KRAS基因突变率比较低。②解剖学分布：低微卫性不稳定的结直肠癌多位于左侧结肠和直肠，伴较高频率的KRAS基因突变；高度微卫性不稳定的结直肠癌多位于右侧结肠，KRAS基因突变率低。③组织学分类：微泡型增生性息肉中80%BRAF基因突变，仅有4%KRAS基因突变；杯状细胞型增生性息肉54%出现KRAS基因突变，BRAF基因突变水平很低或者缺乏。因此BRAF基因突变可能是锯状癌变途径的特殊标记物之一。

表3　KRAS、BRAF基因突变与大肠锯齿状病变患者临床病理特征的关系/例

此外，本文研究还显示，BRAF 基因突变在>65岁患者以及大肠近端情况较多见，BRAF基因是丝/苏氨酸激酶Raf家族的成员，70%的恶性黑色素瘤和 5%~15%结直肠癌有BRAF基因突变，而常见突变为V600E，在既是高CpG岛甲基化又是高度微卫星不稳定性的肿瘤中，BRAF基因突变率高达94%，但在遗传性非息肉性结直肠癌的高度微卫星不稳定性癌和腺瘤则没有BRAF基因的突变。说明遗传性高度微卫星不稳定性癌与散发性高度微卫星不稳定性癌发生机制不同，BRAF基因突变检测可用来区别高度微卫星不稳定性是遗传性或散发性。且BRAF基因突变与KRAS突变呈反相关关系，BRAF基因突变后蛋白过度表达失活由细胞色素C释放引起的caspas通路的活化，从而抑制凋亡，当细胞获得其他突变后，活化的BRAF效应就可驱动细胞增殖，导致肿瘤的发生。

参考文献

[1]李国文,曾山崎,李莉珊,等.广东从化地区高龄大肠癌早期筛查结果分析 〔J〕.中华临床医师杂志(电子版),2015,9(2)：243-245.

[2]冯俊,李志霞.内镜下结直肠锯齿状病变的临床特征 〔J〕.中华胃肠外科杂志,2015,18(1)：83-85.

[3]赵宇,林春香,司空银河,等.结直肠锯齿状腺瘤研究进展 〔J〕.中华消化杂志,2014,34(11)：25-29.

[4]王邦茂,徐东波,王涛,等.结直肠锯齿状腺瘤与传统腺瘤的内镜表现和病理学特征比较 〔J〕.中华消化内镜杂志,2014,31(7)：398-402.

[5]傅松维,竺王玉,何剑营,等.舟山地区原发性肺腺癌EGFR、KRAS、BRAF基因突变及其临床特征探讨 〔J〕.中华检验医学杂志,2014,37(12)：939-941.

[6]Mancini I,Santucci C,Sestini R,et al.The use of COLD-P-

CR and high-resolution melting analysis improves the limit of detection of KRAS and BRAFmutations in colorectal cancer〔J〕.J Mol Diagn,2010,12(5)：705-711.

(编辑：吴小红)

Clinical Application of KRAS,BRAF Gene Mutation in Colorectal Serrated Lesions

LIYanju,CHENRong,ZHANGChunli,etal.AffiliatedHospitalofYan'anUniversity,Yan'an,716000

【Abstract】ObjectiveTo study the clinical application of KRAS and BRAF gene mutation in colorectal serrated lesions.Methods100 cases of colorectal serrated cases of paraffin embedded specimens after resection were selected.Mutation of KRAS and BRAF gene were detected by direct sequencing analysis.ResultsThe colorectal serrated lesions in the KRAS gene mutation rate were 40%,BRAF gene mutation rate was 6.67%.All patients with colorectal serrated lesions were found in 40 cases of KRAS gene mutation,mutation probability was 40%,of which 12,13 of the KRAS gene mutation rate was 30% and 10% respectively.The mutation rate of KRAS gene and the patient's gender and age,clinical and pathological features of the lesion,degree of differentiation and lymph node metastasis were not significantly related (P>0.05).BRAF gene mutation were mainly in patients> 65 or with proximal large intestine.(P<0.05).ConclusionWith the further study of KRAS,BRAF gene mutation,it has important clinical significance in guiding follow-up and evaluating prognosis.

【Key words】KRAS;BRAF;Gene mutation;Colorectal serrated lesions

(收稿日期2015-06-02修回日期 2015-12-21)

中图分类号：R735.3+4

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)04-0523-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.001

基金项目：延安大学附属医院研究生创新基金(编号：12YJ23)