依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用*

韩圣娜，刘　备，孔　岚，李　靓，冯　馨，张　卫，张莉蓉#

1)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001　2)河南省肿瘤医院麻醉科 郑州 450008　3)郑州大学第一附属医院麻醉科 郑州 450052



依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用*

韩圣娜1)，刘备1)，孔岚2)，李靓1)，冯馨1)，张卫3)，张莉蓉1)#

1)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 4500012)河南省肿瘤医院麻醉科 郑州 4500083)郑州大学第一附属医院麻醉科 郑州 450052

关键词依托咪酯；hERG钾通道；全细胞膜片钳；HEK-293细胞

摘要目的：观察依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用及其机制。方法：采用脂质体瞬时转染的方法将野生型hERG(WT-hERG)、突变型Y652A-hERG和F656C-hERG分别转染人胚胎肾细胞HEK-293，应用全细胞膜片钳技术记录依托咪酯对转染后HEK-293细胞表达的hERG钾通道电流的抑制作用以及对激活曲线和失活曲线的影响。结果：依托咪酯可浓度依赖性地抑制WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流，其半数最大抑制浓度为(6.41±2.43) μmol/L，对激活曲线和失活曲线无明显影响。与WT-hERG转染的HEK-293细胞相比，依托咪酯对突变体Y652A-hERG及F656C-hERG转染的HEK-293细胞内钾通道电流的抑制作用减弱。结论：F656C可能是依托咪酯抑制hERG钾通道的重要靶点。

Inhibition effects of etomidate on hERG K+channel expressed in HEK-293 cells

HANShengna1)，LIUBei1)，KONGLan2)，LILiang1)，FENGXin1)，ZHANGWei3)，ZHANGLirong1)

1)DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofAnesthesiology，HenanCancerHospital,Zhengzhou4500083)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsetomidate; hERG K+channel; whole-cell patch clamp; HEK-293 cell

AbstractAim: To investigate the molecular mechanisms of etomidate on hERG K+channel expressed in human embryonic kidney(HEK-293) cells.Methods: HEK-293 cells were transfected transiently with different hERG plasmid (WT, mutant Y652A and F656C, respectively) using lipofection. Whole-cell patch clamp technique was used to record the effects of etomidate on hERG K+channel current,and the activation and inactivation curves expressed in HEK-293 cells. Results: Etomidate directly inhibited WT-hERG K+current in a concentration-dependent manner, and half-maximum block concentration was (6.41±2.43)μmol/L. But etomidate did not markedly modify the activation and inactivation curves of WT-hERG K+channel. The inhibition effects of etomidate on mutant Y652A-hERG and F656C-hERG K+channel were attenuated compared with WT-hERG K+channel.Conclusion: F656C may be the key target that etomidate inhibits the hERG K+channel.

长QT综合征(long QT syndrome，LQTS)是一种严重的心律失常，在围手术期发生率较高，其表现主要为体表心电图QT间期延长、ST-T段异常，严重者可引发尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes，TdP)等恶性心律失常，甚至引起患者晕厥或猝死[1]。QT间期作为心脏安全性的一个重要指标引起越来越多临床医生和药厂的关注。临床上由药物引起的后天获得性LQTS(acquired long QT syndrome，aLQTS)更为常见，许多心血管药物和非心血管药物都可使QT间期延长[2]。这些药物主要通过抑制参与心肌动作电位复极3期的快速激活延迟整流钾通道(rapid activating delayed rectifier K+channel，IKr)，造成细胞内K+外流减少，复极时间延长，整个动作电位时程(action potential duration，APD)延长。而编码IKr通道的基因是hERG(human ether-a-go-go-related gene，hERG)。依托咪酯是一种人工合成的咪唑类衍生物，因其粒子小和分布均匀而具有一定的靶向性，可联合应用多种静脉类或吸入类麻醉药。依托咪酯对QT间期影响的报道不一：有研究认为依托咪酯不影响QT间期[3]甚至缩短QT 间期[4]，但也有文献[5]报道依托咪酯可延长QT间期。在这些报道中，依托咪酯一般都和其他药物同时使用，对机体作用复杂，很难了解依托咪酯单独对QT间期的作用。因此，为全面了解依托咪酯对心脏不良反应的机制，作者采用全细胞膜片钳技术观察依托咪酯对人胚胎肾细胞(human embryonic kidney，HEK-293)上的hERG钾通道电流的影响及其机制，为临床麻醉医师围手术期合理用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1细胞株与质粒HEK-293细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心并由课题组冻存后保存。野生型pcgi-EGFP-WT-hERG质粒由南京师范大学生命科学院张朝教授馈赠，突变型pcgi-EGFP-Y652A-hERG和pcgi-EGFP-F656C-hERG质粒由课题组经PCR定点突变技术而得并保存。

1.2药品、试剂及相关溶液电极内液：MgCl2·6H2O 1 mmol/L，KCl 140 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，Na2ATP 5 mmol/L；用1 mol/L KOH调pH值至7.2。细胞外液：KCl 5.4 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L， MgCl2·6H2O 1 mmol/L；用1 mol/L的NaOH调pH值至7.3～7.4。高K+的细胞外液：KCl 95 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L；用1 mol/L的NaOH调pH值至7.3～7.4。LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，DMEM高糖培养基、青-链霉素购自HyClone公司，质粒小提试剂盒购自Axygen公司，2.5 g/L的胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清购自浙江天杭生物技有限公司，依托咪酯购自江苏恩华药业股份有限公司(溶于DMSO，配成10 mmol/L母液，使用时用细胞外液稀释配成实验所需浓度)。其他试剂均为国产分析纯。

1.3主要仪器IX-71倒置显微镜(Olympus公司，日本)；EPC-10膜片钳放大器(HEKA公司，德国)；Model P-97电极控制仪(Sutter公司，美国)；PCS-5000三维微电极操纵器(Buleigh公司，美国)等。

1.4HEK-293细胞培养和脂质体瞬时转染采用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，于37 ℃、体积分数5%的CO2细胞培养箱中培养HEK-293细胞。选用脂质体瞬时转染的方法将野生型(WT)和突变型(Y652A和F656C)hERG基因分别转染HEK-293细胞，转染36～48 h后取出细胞做全细胞膜片钳记录。

1.5hERG钾通道电流的记录将表达有绿色荧光蛋白(EGFP)的HEK-293细胞置于倒置显微镜载物台上，使用的微电极尖端直径一般0.5～1.0 μm，充以电极内液后阻抗达2～3 MΩ。高阻封接形成后进行串联电阻和电容电流补偿，形成全细胞记录模型。当细胞破膜稳定后，给予细胞维持电位-80 mV，去极化电位-40～+70 mV，持续3 s，复极电位至-40 mV，持续2 s，刺激间隔为15 s，采样频率0.25 kHz。实验过程由计算机软件Pulse 8.67完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。用电压钳模式进行刺激和记录hERG钾通道电流。

1.6统计学处理采用SPSS 13.0进行分析。应用配对t检验比较加药前后WT-hERG钾通道电流的相关参数V1/2和k的变化，应用两独立样本的t检验比较野生型和突变型hERG钾通道电流抑制率的差异，检验水准α=0.05。

2结果

2.1不同浓度依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的抑制作用依托咪酯采用5个浓度(0.001、0.01、0.1、1.0、10和100 μmol/L)，以依托咪酯的对数浓度(Log μmol/L)为横坐标，加药前后的相应电流比值为纵坐标，得药物抑制WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的量-效关系曲线(图1)。用Hill公式计算依托咪酯抑制WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的IC50值。Idrug/Icontrol=1/[1+(D/IC50)n]，其中D为药物的浓度值，IC50值为药物抑制hERG钾电流一半时的药物浓度(IC50)，n为Hill系数。经Hill公式得出依托咪酯抑制WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的IC50值为(6.41±2.43)μmol/L，Hill系数为0.37±0.06。

2.2依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的抑制作用见图2、表1和2。图2A显示，加入10 μmol/L依托咪酯4～5 min时电流基本趋于稳定，故该实验均以加药5 min后作为观察药物作用效果的时间点。图2B显示的是10 μmol/L依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的抑制作用。表1和表2分别显示了相应电压下依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞的时间依赖性电流和尾电流的I-V曲线的影响。

图1　依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的量效关系曲线

A：同一细胞应用10 μmol/L依托咪酯5 min内钾通道电流的变化；B：10 μmol/L依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的抑制作用。图2　10 μmol/L依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的抑制作用

电压/mV加药前电流密度(pA/pF)加药后电流密度(pA/pF)tP-303.70±1.193.47±1.400.2760.791-208.30±2.2316.60±2.120.2760.423-1016.17±3.5811.35±3.190.8380.191024.66±3.9115.89±3.331.4490.0451031.21±3.8019.68±3.322.4400.0022032.52±4.9019.47±3.094.5290.0013029.09±6.5117.45±4.095.1400.0044022.05±7.2214.78±4.244.0550.1615016.08±6.1212.93±4.671.5600.5126010.44±4.757.37±3.960.6840.117706.56±3.894.76±3.361.7770.081

表2　10 μmol/L依托咪酯对转染的

2.3依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流激活曲线和失活曲线的影响以电压为横坐标，相应电压下的尾电流值与尾电流最大值(一般在+30 mV)的比值为纵坐标作图，数据经Boltzman方程拟合，即可得到WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的稳态激活曲线和参数。Boltzman方程为：I/Imax=1/(1+exp((V1/2-Vm)/k)，式中V1/2为通道达1/2激活时的膜电位，k是当Vm=V1/2时的最大斜率因子。在+20 mV、4 000 ms的去极化之后，给予快速去极化脉冲的刺激，记录-130～+20 mV电位下的电流，经过Boltzmann方程拟合即可得出稳态失活曲线和参数(表3)。

2.4依托咪酯对Y652A-hERG和F656C-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的作用见图3、4和表4、5。由图4可知，10 μmol/L的依托咪酯对

WT-hERG和Y652A-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流均有抑制作用，而Y652A的突变削弱了10 μmol/L依托咪酯对hERG电流的抑制作用。由于F656C-hERG钾通道具有细胞膜低表达的特点，用正常细胞外液不易引出外向尾电流，实验中采用含高钾的细胞外液(K+95 mmol/L)，先给予细胞一个+20 mV的去极化脉冲，随后将细胞复极至-120 mV，引出其内向尾电流，图4显示了在高钾细胞外液下10 μmol/L的依托咪酯分别作用于WT-hERG和F656C-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流的变化。

表3　依托咪酯对WT-hERG转染的HEK-293

图3　依托咪酯对Y652A-hERG转染的HEK-293细胞钾电流的抑制作用

图4　依托咪酯对F656C-hERG转染的HEK-293细胞钾电流的抑制作用

%

表5　依托咪酯对野生型和突变型F656C-hERG

3讨论

有文献[6]报道，麻醉维持期间依托咪酯的血浆药物浓度为1.23～2.05 μmol/L，镇静浓度为0.61～1.23 μmol/L，清醒时0.61～1.02 μmol/L。该实验结果显示依托咪酯能浓度依赖性的抑制hERG钾通道电流，其IC50值为(6.41±2.43)μmol/L，高于依托咪酯正常使用剂量下的血药浓度，这说明在正常剂量下使用依托咪酯，是比较安全的，但是当依托咪酯使用剂量过大时，其临床血药浓度升高会有发生QT间期延长的潜在危险，这是值得麻醉医生提高警惕注意的问题。

随之，该实验又探讨了依托咪酯能够抑制hERG钾通道的分子机制。在hERG钾通道的6个跨膜区域(S1-S6)中，S6区的氨基酸残基是很多药物保守结合位点，其中652位置的酪氨酸(Y652)和656位置的苯丙氨酸(F656)是药物的主要结合位点[7]。为了进一步了解依托咪酯抑制WT-hERG钾通道的机制是否与Y652和F656有关，作者观察了依托咪酯对Y652A(第652位酪氨酸突变为丙氨酸)和F656C(第656位苯丙氨酸突变为半胱氨酸)突变体的阻滞作用。选用的依托咪酯的浓度为10和100 μmol/L(超过依托咪酯抑制WT-hERG钾通道的IC50的1.5和15.0倍)，观察高浓度的依托咪酯是否能够抑制突变后的hERG钾通道电流，结果显示Y652A突变削弱了10 μmol/L依托咪酯阻断hERG钾通道的能力(约2倍)，而当依托咪酯为100 μmol/L时，其对WT和Y652A抑制的程度差异无统计学意义。F656C突变后，与野生型相比，依托咪酯(10和100 μmol/L)分别抑制hERG钾通道电流的程度减弱3.56和3.64倍，相比而言F656可能是依托咪酯阻断hERG钾通道的关键结合位点。

虽然依托咪酯以对心血管影响较小的优势而在临床应用广泛，但是通过该实验证实，依托咪酯能够阻断hERG钾通道，在使用浓度较高时仍有发生QT间期延长的潜在危险。另一方面，围手术期发生LQTS的因素除与麻醉药物本身有关外，还受到很多因素的影响。QT间期是反映心肌复极时程的一个重要指标，是一个动态的生理变数，受多种因素如年龄、性别、心率、活动状态、药物和电解质浓度、患者本身疾病等的影响。手术本身也是造成QT间期延长的危险因素，如麻醉诱导期喉镜和气管插管刺激可使交感神经兴奋；引起QT间期延长；手术操作刺激和牵拉也可反射性地引起迷走神经兴奋，导致心率减慢，使QT间期延长。

综上所述，患者围手术期出现QT间期延长，往往是多种因素相互作用的结果，提醒麻醉医生应认真分析原因，高度警惕引起QT间期延长的潜在因素，做全面的围术期风险评估，针对不同体质的患者选择合适的药物，尽量避免心脏不良反应的发生。

参考文献

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[2]MICHELS G,KOCHANEK M,PFISTER R.Life-threatening cardiac arrhythmias due to drug-induced QT prolongation:a retrospective study over 6 years from a medical intensive care unit[J].Med Klin Intensivmed Notfmed,2015.[Epub ahead of print]

[3]朱惠敏.获得性Q-T间期延长综合症患者的麻醉观察[J].中国农村卫生事业管理,2010,30(10):885

[4]王亚辉,王家和,尹大光.静脉麻醉药对QT间期的影响[J].临床麻醉学杂志,1996,12(3):137

[5]ERDIL F,DEMIRBILEK S,BEGEC Z,et al.Effects of propofol or etomidate on QT interval during electroconvulsive therapy[J].J ECT,2009,25(3):174

[6]PASSOT S,SERVIN F,PASCAL J,et al.A comparison of target- and manually controlled infusion propofol and etomidate/desflurane anesthesia in elderly patients undergoing hip fracture surgery[J].Anesth Analg,2005,100(5):1338

[7]马新方,韩圣娜,张雨,等.罗红霉素对转染HERG基因人胚肾上皮细胞HERG钾通道的抑制作用[J].郑州大学学报(医学版),2010,45(5):763

中图分类号R322.1；R978.1

#通信作者，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向：药物不良反应，E-mail：zhanglirongzzu@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.017

*国家自然科学基金青年基金项目81200138