潍坊地区奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定及药敏试验

辛萍萍 王金君 胡士林 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）



潍坊地区奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定及药敏试验

辛萍萍 王金君 胡士林 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

摘要本研究调查了潍坊地区6个奶牛场的1971头分娩奶牛，对50头患牛进行病原菌 分离鉴定，分离到6种病原菌共54株。结果表明，引起奶牛子宫内膜炎的主要病原菌包括链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、化脓放线菌，其次是变形杆菌、绿脓杆菌和真菌等。

关键词奶牛 子宫内膜炎 病原菌 分离鉴定

子宫内膜炎是奶牛牛场三大疾病之一，是造成奶牛不孕的主要原因。子宫内膜炎不仅影响繁殖，也影响奶牛的产奶，甚至威胁奶牛的生命。每年因治疗奶牛子宫内膜炎而造成的经济损失非常巨大。本试验对潍坊地区奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定及药敏试验，以期为该病的防治提供数据依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物 试验牛均来自潍坊地区6个规模化奶牛场，经临床检查，可疑为子宫内膜炎奶牛共计50头，另选择10头健康牛做对照组，分别收集子宫分泌物进行微生物检查。

1.2 试验时间 2015年7月10日～8月30日。

1.3 培养基 LB肉汤、营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、10%兔血琼脂培养基、西蒙氏柠檬酸盐培养基、葡萄糖酸盐培养基、苯丙氨酸培养基、M.R.V.P培养基、甘露醇培养基、乳糖发酵管培养基等，均按常规方法配制[1]。各种生化试剂和药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.4 诊断 直肠检查结合子宫分泌物观察确诊病例[2]。阴道检查时，子宫颈松弛，外口稍为开张，子宫颈阴道部充血肿胀，从子宫内流出透明或混浊的分泌物，甚至流出暗红色或灰色黏液。

1.5 采样 采样前先用0.1%高锰酸钾消毒液清洗被检奶牛的外阴部，然后用灭菌输精管，按人工授精术式无菌操作送入子宫颈，采取分泌物2ml注入灭菌的青霉素瓶中，封盖并贴上标签置于冰箱(4℃)保存，送实验室待检，整个采样过程尽量避免污染。

1.6 细菌的分离和鉴定 （1）细菌分离：将病料接种于血琼脂平板，37℃培养24～48h，挑取血琼脂平板上生长比较一致的单个菌落，转接至普通营养肉汤，37℃培养24～48h后转接至普通营养琼脂板后，37℃培养24～48h后进行鉴定[3]。（2）细菌鉴定：挑起普通营养肉汤中菌液，涂片，进行革兰染色，镜检。革兰阳性球菌呈葡萄串状、成双或单个排列或呈链状、短链或长链，先进行过氧化氢酶试验，有气泡者再进行凝固酶试验，无气泡则按链球菌鉴定方法进一步做甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、淀粉等发酵试验，以及明胶水解试验、40%胆汁培养试验、胆汁溶菌试验等[4-5]。革兰阴性杆菌先接种于麦康凯平板，37℃培养24h后，菌落呈红色，按肠科杆菌进行生化鉴定，鉴定按照杭州天和微生物试剂有限公司肠杆菌科细菌生化编码鉴定管(GYZ215e)说明进行操作。

1.7 药物抑菌试验 采用世界卫生组织推荐，目前各实验室广泛采用的药物纸片琼脂扩散法(disc agar diffusion)[6]进行药物敏感性试验，所选抗菌药物有：青霉素、链霉素、四环素、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、头孢拉定、阿莫西林、卡那霉素、氟哌酸、恩诺沙星等。抗菌效果判定按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的标准方法。具体为将分离鉴定的大肠杆菌和葡萄球菌分别接种于肉汤培养基，链球菌接种于血清肉汤培养基，37℃培养24h，适当稀释后吸取150μl加到普通琼脂(大肠杆菌和葡萄球菌)和血清琼脂(链球菌)平板内，用“T”型涂布棒涂匀，再用无菌镊子将药敏纸片分别贴到平板上，37℃培养24h后测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 细菌鉴定结果 10头健康牛中有3头分离得到3株细菌，其中2头牛分离得到大肠杆菌，一头牛分离得到链球菌。50头患病牛其中4头牛未分离出病原菌，46头分离得到6种病原菌共54株。其中葡萄球菌17株，占总菌株数的31.48%；链球菌19株，占总菌株的35.19%；大肠杆菌7株，占总菌株的12.96%；绿脓杆菌3株，占总菌株的5.56%；蜡状孢芽杆菌2株，占总菌株的3.70%；沙门氏杆菌6株，占总菌株的11.11%。60头牛病原菌分离结果见表1。

图1　大肠杆菌

图2　大肠杆菌(金属光泽)

图3　绿脓杆菌

图4　葡萄球菌

表1　试验组及对照组分离细菌鉴定结果

50头患病奶牛感染病原中，单一感染38头牛，占82.61%，混合感染8头，占17.39%，子宫内膜炎患牛病原菌感染情况见表2。

表2　试验组奶牛细菌感染情况

2.2 药敏试验结果 由表3分析试验结果表明，抗菌药物中对主要病原菌葡萄球菌抑菌作用最强的是环丙沙星、恩诺沙星，抑菌圈直径分别为20.6mm、21.6mm都呈极敏状态，其次对青霉素、链霉素、庆大霉素高敏，直径都大于14mm，对红霉素中敏，直径为11.7mm，对四环素、头孢拉定、阿莫西林、卡那霉素、氟哌酸等低敏，抑菌直径都在10mm以下。抗菌药物中对链球菌抑菌作用最强的是环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、头孢拉定，都呈极敏状态，直径都在20mm以上，其次对青霉素、红霉素、卡纳霉素中敏，直接都在10～14mm，对庆大霉素、阿莫西林、卡那霉素、氟哌酸等低敏，抑菌直径都在10mm以下。抗菌药物中对大肠杆菌抑菌作用最强的是链霉素、庆大霉素、环丙沙星、头孢拉定、恩诺沙星，都呈极敏状态，直径都在20mm以上，其次对四环素、卡那霉素、氟哌酸高敏，直径在14～20mm，对青霉素中敏，直接都在10～14mm，对红霉素、阿莫西林等低敏，抑菌直径都在10mm以下。

表3　子宫内膜炎病原菌对药物抑菌圈直径 (mm)

3 讨论

（1）引起奶牛子宫内膜炎的主要病原菌包括链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、化脓放线菌，其次是变形杆菌、绿脓杆菌和真菌等。上述细菌可以通过不洁净的牛场、粪污的运动场、人工授精、助产、胎衣剥离等途径进入牛体产道子宫，从而感染疾病。因此在预防子宫内膜炎方面，应该做好消毒防疫，减少病菌滋生的场所，切断病菌传染的途径。（2）抗生素疗法是治疗子宫内膜炎最常见的方法，但是由于使用长期使用单一抗生素治疗，是奶牛出现明显的耐药性，治疗效果明显降低，因此如何选择合适的抗生素治疗奶牛子宫内膜炎也很重要。本试验通过对青霉素、链霉素、四环素、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、头孢拉定、阿莫西林、卡那霉素、氟哌酸、恩诺沙星等药物做抑菌试验，选择耐药性较低的抗生素如头孢拉定、环丙沙星、恩诺沙星等治疗奶牛子宫内膜炎，并交替使用，疗效会明显提高。

4 结论

在50头患病牛中有46头分离到6种病原菌共54株。其中葡萄球菌17株，占总菌株数的31.48%；链球菌19株，占总菌株的35.19%；大肠杆菌7株，占总菌株的12.96%；绿脓杆菌3株，占总菌株的5.56%；蜡状孢芽杆菌2株，占总菌株的3.70%；沙门氏杆菌6株，占总菌株的11.11%；单一感染38头牛，占82.61%；混合感染8头，占17.39%。

参考文献

[1] 周庭银. 临床微生物学诊断与图解[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2007.

[2] 赵兴绪. 兽医产科学.第3版[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002.

[3] R. E. 布坎南, N. E. 吉本斯. 中国科学院微生物研究所, 伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M]. 北京: 科学出版社, 1984: 382-462.

[4] 陆承平. 兽医徽生物学第3版[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001, 214, 237.

[5] 姚火春. 兽医微生物学实验指导第2版[M]. 北京: 中国农业出版社. 36-45.

[6] 徐腊梅, 冯万宇, 王岩等. 奶牛子宫内膜炎研究进展[J]. 动物医学进展, 2008, 29(8); 71-74.

收稿日期：（2015–12–30）

基金项目：山东省现代农业产业体系（SDAIT-12-011-05）

中图分类号：S858.23

文献标识码：A

文章编号：1007-1733(2016)03-0005-02