布洛芬对MyD88基因沉默中性白细胞中NF-kB蛋白表达的影响*

任　飞， 王婷婷， 王春雷

(中国医科大学附属第一医院 老年医学科, 辽宁 沈阳　110001)



布洛芬对MyD88基因沉默中性白细胞中NF-kB蛋白表达的影响*

任飞， 王婷婷， 王春雷**

(中国医科大学附属第一医院 老年医学科, 辽宁 沈阳110001)

[摘要]目的： 研究布洛芬对脂多糖(LPS )介导的MyD88基因沉默中性白细胞中一氧化氮(NO)产生能力和TLR4-NF-kB通路中核转录因子kB(NF-kB)蛋白表达的影响。方法： 用密度梯度法分离正常健康者外周血中性白细胞并用免疫磁珠纯化，用Nucleofection转染系统将MyD88 siRNA基因转染入纯化后的中性白细胞；用0、5、10、50及100 μmol/L布洛芬联合1 mg/L LPS分别刺激正常中性白细胞和已转染的MyD88基因沉默的中性白细胞，用流式细胞仪检测已沉默MyD88基因的中性白细胞中NO水平，用Western Blot检测 MyD88和NF-kB蛋白表达水平。结果： 不同浓度的布洛芬均可以明显抑制正常中性白细胞和MyD88基因沉默中性白细胞产生NO，并呈剂量依赖，50 μmol/L布洛芬浓度时抑制率最高；正常人中性白细胞MyD88和NF-κB的表达水平也随布洛芬浓度升高而降低， 50 μmol/L布洛芬时对MyD88和NF-κB的抑制率最高；选择50 μmol/L布洛芬处理正常中性白细胞和MyD88基因沉默的中性白细胞，可明显抑制正常和MyD88基因沉默中性白细胞中MyD88-和NF-κB蛋白的表达，与仅加LPS组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；正常细胞和MyD88基因沉默细胞之间产生NO水平和MyD88-、NF-κB蛋白的表达水平比较P>0.05。结论： 布洛芬可抑制LPS介导的MyD88基因沉默中性白细胞中NO产生，其机制可能与下调MyD88和 NF-κB蛋白水平有关。

[关键词]布洛芬； 核因子-κB； MyD88； 基因沉默； 中性白细胞

布洛芬(异丁苯丙酸，Ibuprofen)为非甾体类解热镇痛药、其消炎、镇痛、解热作用显著，不良反应较小，在世界范围内得到广泛应用。有研究发现，布洛芬可缓解博莱霉素诱导的肺纤维化，其机制与抑制一氧化氮(nitrite oxide，NO)的产生和调控toll样受体4(toll like receptor, TLR4)有关，布洛芬可通过下调博莱霉素诱导的肺纤维化鼠肺泡灌洗液中MyD88的蛋白表达水平，从而降低NO含量、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等炎症因子的含量，减轻肺纤维化[1]。中性白细胞的TLR4主要通过依赖MyD88途径和非依赖MyD88途径(即TRIF途径)起作用[2-3]，其中MyD88是TLR信号通路中关键的转接分子[4-6]。无论是MyD88依赖性途径还是非MyD88依赖性途径均可激活NF-κB和MAPK信号通道，引起一系列的炎症介质反应[7-9]。本研究通过沉默中性白细胞中MyD88基因，用不同浓度的布洛芬和LP处理细胞，探讨布洛芬对抑制MyD88基因沉默中性白细胞产生NO能力及对MyD88依赖性或MyD88非依赖性途径和其下游NF-kB调控的关系。

1材料与方法

1.1材料与试剂

布洛芬购自烟台第二制药厂，Human Neutrophil Enrichment Kit购自Stemcell (Vancouver, Canada)，纯化LPS购自Invivogen (San Diego, CA, USA)。MyD88 GeneSolution siRNA购自 QIAGEN (Cambridge, MA, USA)，MyD88和NF-kB抗体购自Cell Signaling (Beverly, MA, USA)，Ficoll 购自GE (Pittsburgh, PA, USA)，RPMI 1640培养基购自(fetal bovine serum， FBS) ，小牛血清购自Hyclone (Logan, UT, USA)。

1.2分离和纯化中性粒细胞

取健康人新鲜抗凝静脉血20 mL，与PBS 1∶1混匀稀释，按2∶1加于淋巴细胞分离液；2 000 r/min离心20 min，弃去第1层血浆层和第2层细胞层，收集第3层分离液层和第4层红细胞层，加入5 mL PBS充分混匀，1 000 r/min离心10 min，吸弃上清液，收集细胞沉淀，加入6～10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解红细胞10 min。 400～500 r/min离心5 min，弃红色上清。加入适量PBS重悬沉淀，400～500 r/min离心3 min，弃上清液，收集细胞沉淀，按5×107个细胞给予10 μL的磁珠抗体进行隐形筛选纯化细胞，得到中性白细胞。

1.3沉默MyD88基因

使用Nucleofection (Amaxa, Germany)转染系统。细胞沉淀用100 μL转染液重悬(细胞浓度约为1×106)并转移到1.5 mL转染杯中，加入MyD88 Gene solution siRNA 5 μL混匀，调节转染仪为优化状态完成转染。通过阳性对照的荧光标记，应用流式细胞仪鉴定转染效率约为70%。对照组也进行相同的转染过程，以排除转染过程对实验的影响。细胞在培养液中孵育2 h备用。

1.4分组及布洛芬处理细胞

将布洛芬配成10 mmol/L的储存液，每次试验时配成终浓度(现用现配)为5、10、50及100 μmol/L应用液。将沉默MyD88基因的中性白细胞和正常中性白细胞沉淀用PMI1640培养液重悬，均分别均分为5份接种到24孔板，分别为LPS组(未加布洛芬)、LPS+5 μmol/L布洛芬组、LPS+10 μmol/L布洛芬组、LPS+50 μmol/L布洛芬组和LPS+100 μmol/L布洛芬组，5组均分别给予1mg/L LPS刺激细胞。将所处理过的细胞置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中30 min后，进行相应检测。

1.5NO浓度检测

采用流式细胞仪，应用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2,7-Dichlorodihy-drofluorescein diacetate,DCFH-DA)可以自由通过细胞膜进入胞内，被酯酶水解成DCFH，DCFH与胞内活性氧(reactive o xygen species,ROS)ROS反应生成7′二氯荧光素(7′-Dichlorofluorescein，DCF)，DCF被488 nm激光器激发后能发出530 nm的荧光信号，被异硫氰酸荧光素(FITC)通道接受换算成NO浓度。在各组的细胞悬液中加入DCFH-DA 1 mL，使其终浓度为10 μmol/L，孵育30 min；PBS终止反应，离心并重悬细胞，立刻使用流式细胞仪检测，以LPS组产生的NO浓度作为100%，计算各组产生NO的百分率。

1.6MyD88和NK-κB蛋白表达

采用western blot方法，细胞沉淀经细胞裂解液100 μL裂解后，12 000 r/min离心30 min，用碱性酚法测定上清液的蛋白浓度并调制相同的总蛋白浓度。蛋白样品按4∶1加入上样缓冲液，煮沸5 min；各取15 μL蛋白样品，经10%的SDS-PAGE电泳分离，并以湿转法转到PVDF膜上；在室温下用5%的脱脂奶粉进行封闭2 h，并用TBST洗涤3次，然后用5%的BSA抗体缓冲液按1∶1 000稀释抗体(分别为MyD88和NF-κB抗体)，孵育PVDF膜，过夜；然后洗涤3遍，进行二抗孵育2 h。将膜洗涤3次后，ECL发光后用图像分析仪进行图像分析。

2结果

2.1NO水平

从图1可以看出不同浓度的布洛芬均可以明显抑制正常中性白细胞和MyD88基因沉默中性白细胞产生NO，并呈剂量依赖，处理的布洛芬浓度越高抑制能力越强，在50 μmol/L布洛芬浓度时抑制率最高。布洛芬抑制MyD88基因沉默中性白细胞产生NO能力强于正常中性白细胞，但差异无统计学意义(P>0.05)。

图1　布洛芬对两种中性白细胞产生NO能力的影响Fig.1　The effect of ibuprofen on NO production ability in normal neutrophils and MyD88 gene-silencing neutrophils

2.2MyD88和NF-κB蛋白表达

图2　布洛芬对LPS介导人中性白细胞产生MyD88和NF-κB表达的影响Fig.2　The effect of ibuprofen on MyD88 and NF-kB expression in human neutrophils mediated by LPS

结果表明，布洛芬均可抑制正常人中性白细胞MyD88和NF-κB的表达，呈剂量依赖性， 50 μmol/L布洛芬时抑制率最高，对MyD88抑制率约为50%、NF-κB为90%，见图2。故选择50μmol/L布洛芬处理组研究布洛芬对MyD88基因沉默中性白细胞的MyD88和NF-κB蛋白表达的影响，如图3所示，50 μmol/L布洛芬可明显抑制正常和MyD88基因沉默中性白细胞中MyD88-和NF-κB蛋白的表达；与仅加LPS刺激比较，差异有统计学意义(P<0.01)；而正常细胞和MyD88基因沉默细胞中MyD88和NF-κB蛋白表达的抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图3　布洛芬对正常和MyD88基因沉默中性白细胞MyD88和NF-κB表达的影响 Fig.3　The effect of ibuprofen on MyD88 and NF-kB expression in normal neutrophils and MyD88 gene-silencing neutrophils

3讨论

MyD88是TLR信号通路中关键的转接分子，TLR4是单一的TLR受体，通过2条途径激活，一是依赖MyD88途径，另一是非依赖MyD88途径(即TRIF途径)[2]。无论是MyD88依赖性还是非MyD88依赖性途径均可激活NF-κB通道和MAPK通道。TLR4与炎症相关性疾病之间有着密切的联系，大量的研究显示 TLR4/NF-κB信号通路在炎症信号的传递中发挥着重要作用[6]。其中NF-κB诱导激酶激活I-κB家族α、β激酶，导致I-κB家族的广泛磷酸化而降解，激活并最终启动TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12等细胞因子以及辅助刺激分子CD80、CD83和CD86基因的转录，产生相应的生物效应[10]。Konstan等[11]研究证实长期服用布洛芬胶囊，血浆浓度波动在8～90 μmol/L，平均血药峰浓度可以达到50 μmol/L，此剂量可有效减缓囊性纤维化患者肺部疾病的进展，并可制嗜中性白细胞迁移到肺。因此选用5～100 μmol/L浓度布洛芬用于本次研究。在哺乳动物体内，NO是L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)催化下生成的，虽生成的NO量较少, 但具有广泛的生理功能, NO具有调节血压、扩张血管及抑制血小板聚集等作用，在防止心血管疾病的发生发展方面发挥重要的保护作用。本研究用流式细胞仪观察布洛芬对LPS介导人中性白细胞产生NO的能力，结果证明50 μmol/L布洛芬就能明显抑制NO的产生，抑制能力达到最大。结果还显示布洛芬呈剂量依赖性抑制正常人中性白细胞MyD88和NF-κB的表达，结果与布洛芬抑制NO的产生一致，即50 μmol/L布洛芬即可产生有效抑制作用。因此，本研究用50 μmol/L布洛芬处理MyD88基因沉默中性白细胞后检测其MyD88和NF-κB的表达，发现对MyD88基因沉默中性白细胞，布洛芬的作用更加明显，说明布洛芬可能部分通过MyD88的下调，抑制NF-κB的表达，从而降低NO的产生。综上，布洛芬可抑制LPS介导的MyD88基因沉默中性白细胞中NO产生，可能与下调MyD88和 NF-κB蛋白水平有关。对于布洛芬是否影响非依赖性MyD88通道，有待于进一步研究证实。

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(2015-12-25收稿，2016-02-08修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

·临床研究·

Effect of Ibuprofen on Protein Expression of NF-κB in MyD88-knockdown Human Neutrophils

REN Fei, WANG Tingting, WANG Chunlei

(DepartmentofGeriatrics,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,Liaoning,China)

[Abstract]Objective: To explore the effect of ibuprofen on NO production in LPS mediated MyD88 knockdown human neutrophils and NF-kB protein expression in TLR4-NF-κB pathway. Methods: Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation was adopted to isolate the neutrophils from the peripheral blood of healthy people and Easysep Neutrophil Enrichment Kit was used to purify neutrophils. Nucleofection technology was adopted to transfer MyD88 siRNA into the purified neutrophils. The cells were inbucated with ibuprofen (5 μmol/L, 10 μmol/L, 50 μmol/L and 100 μmol/L) combined with 1mg/L LPS respectively to stimulate normal neutrophils and transfected MyD88 gene-silencing neutrophils. Flow cytometry was adopted to detect NO level in MyD88 gene-silencing neutrophils and Western Blot was used to detect protein expression level of MyD88 and NF-kB. Results: Different concentration of ibuprofen could significantly inhibit NO produced by normal neutrophils and transfected MyD88 gene-silencing neutrophils in dose-dependent way, with 50 μmol/L of ibuprofen showing the highest inhibition rate. The protein expression level of MyD88 and NF-kB in normal neutrophils decreased with the increase of ibuprofen concentration, with 50 μmol/L of ibuprofen showing the highest inhibition rate for protein expression level of MyD88 and NF-kB. 50 μmol/L of ibuprofen was selected to stimulate normal neutrophils and transfected MyD88 gene-silencing neutrophils and significantly inhibit protein expression level of MyD88 and NF-kB. Compared with only LPS group, the differences were statistically significant (P<0.01). There was no significant difference in NO level and protein expression level of MyD88 and NF-kB between normal neutrophils and transfected MyD88 gene-silencing neutrophils (P>0.05). Conclusion: Ibuprofen can inhibit LPS-mediated NO produced from MyD88 gene-silencing neutrophils and the possible mechanism may be related to down-regulation of protein expression of MyD88 and NF-κB.

[Key words]ibuprofen; nuclear factor-κB; MyD88; gene silence; knock-down; neutrophils

[中图分类号]R34-33

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)03-0310-04

*[基金项目]辽宁省教育厅高校科研基金资助项目(2010686)

**通信作者 E-mail:wcl201010@163.com

网络出版时间：2016-03-17网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1044.038.html