污水处理厂耐β—内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌Ⅰ类整合子及基因盒研究

徐佳丽+王小娇+张明+任雪丽+江涛

摘 要：该文首先用 PCR等方法，对闵行污水处理厂分离的β-内酰胺类抗性菌株中Ⅰ类整合子和基因盒的存在情况进行测定；其次，对含有Ⅰ类整合子-基因盒的抗性菌株抽提质粒，分析Ⅰ类整合子-基因盒所在位置；最后，探讨了含有整合子-基因盒菌株对多种抗生素的反应。

关键词：β-内酰胺类抗性菌株；Ⅰ类整合子；基因盒

中图分类号 X703 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）07-15-03

Abstract：In this paper，PCR techniques were used to detect the presence of classⅠintegron and gene β-lactam antibiotics which selected from sewage water samples. Second，the plasmid DNA were extracted from β-lactam resistant strains with classⅠintegron and gene cassette，which detected the position of classⅠintegron and gene cassette. Finally，the response of a strain containing classⅠintegron and gene cassette to antibiotics were investigated.

Key words：β-lactam antibiotics；ClassⅠintegron；Gene cassettes.

1 前言

随着抗生素使用越来越频繁，细菌具有了更强的抗药性，从而使耐药性广泛传播。耐药基因的水平传播主要由质粒、转座子、噬菌体介导，而整合子起着至关作用[1]。Stokes[2]在1989年首次提出了整合子的概念，Hall[3]在1991年正式提出了基因盒-整合子系统的概念。整合子是细菌DNA片段，与细菌耐药性密切相关[4]，是一种存在于细菌质粒或染色体上的遗传元件系统，通过自身编码的整合酶来获取外源基因并使之表达。

整合子由5′-保守末端（CS）、3′-保守末端及位于2段保守序列之间的可变区组成，它能够捕获、整合及表达耐药基因。5′-CS是整合子的基本结构，包括一个编码整合酶的IntⅠ基因、一个整合子重组位点attI和启动子（Pant）[5]。中间可变区域有不同种类和数量的耐药基因盒，表现出多耐药特征。而基因盒是一种结构比较小的、自己无法转录翻译，需要借助外界力量来帮助自己表达，而整合子经常是它的首选目标。基因盒通过整合子上整合酶被整合到整合子中或从整合子里被剪切下来，使耐药基因得以传播与扩散[6]。3'-CS的结构因整合子种类而不同。

到目前为止，Ⅰ类整合子是研究最多也是被检测到最多的。Ⅰ类整合子的5′-CS部分一般相似，而3′-CS存在差异。多数3′-保守端有3个开放的基因读码框：磺胺耐药基因（SulⅠ），季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因（qacE△1），以及功能尚不清楚的ORF5[5]。本实验主要通过PCR等方法检测污水厂分离的39株抗性菌株的Ⅰ类整合子以及基因盒的存在情况。通过对含有Ⅰ类整合子-基因盒系统的抗性菌株提取质粒，分析Ⅰ类整合子-基因盒所在的位置。最后，探讨了整合子在介导LFE对抗生素产生多重抗性的作用。

2 实验方法

2.1 样本采集及DNA的提取 实验菌株来自闵行污水厂中分离的39株耐β-内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌。用水煮法（99.5℃，10min）裂解提取菌落DNA。同时做好标记保存使用。

2.2 抗性菌株Ⅰ类整合子基因检测 将水煮提取的39个菌落DNA在Ⅰ类整合子基因扩增引物下进行PCR检测，反应总体系为30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，3μL dNTPs，正、反向引物各0.6μL，2μL DNA模板，0.2μL的Taq聚合酶，18.8μL超纯水。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变型30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。最后在1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2.3 抗性菌株Ⅰ类整合子基因盒检测 用上述使用过的39个菌落DNA在Ⅰ类整合子基因盒扩增引物下进行PCR检测，反应总体系为30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，6μL dNTPs，正、反向引物各1.2μL，4μL DNA模板，0.4μL的Taq聚合酶，12.4μL超纯水。PCR扩增条件为：94℃预变性7min，94℃变型40s，59℃退火40s，72℃延伸80s，30个循环，72℃延伸10min，最后在1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2.4 带Ⅰ类整合子抗性菌株整合子位置确定 用质粒抽提试剂盒（桑尼生物科技有限公司）对闵行污水厂中分离的39株耐β-内酰胺类乳糖发酵型肠杆菌抽提质粒。用PCR方法对抽提的质粒做整合子及基因盒检测，步骤同上面2个实验相同。

2.5 β-内酰胺类抗性菌株对多重抗生素的耐药性研究 将分离出的含有39株β-内酰胺抗性菌株分别转接于含有浓度为50μg/mL的氨苄西林钠、16μg/mL的头孢呋辛钠、20μg/mL的四环素的麦康凯琼脂平板中，37℃培养24h。

3 结果与分析

3.1 抗性菌株Ⅰ类整合子-基因盒检测结果 取9、10、11月从闵行污水处理厂分离出的39株具有2种以上抗性基因的Ⅰ类整合子-基因盒检测结果，见表1。从表1可以得出：在分离的39株具有多个抗性基因的菌株中，其中约15.38%含有Ⅰ类整合子但不含有基因盒；15.38%含有基因盒但是在intⅠ上没有检测到；同时15.38%的菌株检测出Ⅰ类整合子及基因盒，另外约有30.77%未含有Ⅰ类整合子和基因盒。其中对于都含有Ⅰ类整合子及基因盒的月份上分析：11月份<9月份<10月份，这在一定程度上反应出耐药性的传播和抗药性的爆发期可能与时间有关。由此可知，环境中含有较多的Ⅰ类整合子-基因盒这个系统结构的菌株与环境中细菌抗性药提高有着密切联系。

3.2 Ⅰ类整合子-基因盒位置的分析 对含有Ⅰ类整合子-基因盒的6株菌进行了对该系统位置的研究，结果表明，这6株菌的质粒DNA也都能检测到该系统，说明这6株的Ⅰ类整合子-基因盒系统均位于质粒上。

3.3 β-内酰胺类抗性菌株多重耐药性的研究 携带Ⅰ类整合子-基因盒系统的抗性菌株在不同抗生素中生长情况，结果见表3。从表3可以看出：SA15、OC4、OD6这3株菌能在氨苄西林钠、头孢呋辛钠、四环素这3种抗生素中生长，说明这3株菌对这3种抗生素都具有抗性，即为多重抗性菌。另外，这也从侧面反映出含有Ⅰ类整合子-基因盒的细菌对抗生素极易表现出多重抗性。

4 结论

在闵行污水处理厂分离出的39株带有多重抗性的菌株中，Ⅰ类整合子的检出率为30.77%，基因盒的检出率为30.77%，同时带有整合子-基因盒系统的检出率为15.38%[7]。对6株含有Ⅰ类整合子-基因盒的β-内酰胺类抗性菌株对其质粒检测，结果发现在这6株菌的质粒上都检测到了Ⅰ类整合子-基因盒的存在。β-内酰胺类抗性菌株中的Ⅰ类整合子-基因盒可能位于质粒上。整合子在介导β-内酰胺类抗性菌株对抗生素产生多重抗药性的过程中起到了重要作用。

参考文献

[1]冯银，陈体，伍勇.整合子介导细菌耐药调控机制的研究进展[J].国际检验医学杂志，2013，34（10）：1260-1262.

[2]Stokes HW，Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions： integrons [J]. Mol Microbiol，1989，3（12）：669-1683.

[3]Hall R M，Collis C M. Mobile gene cassettes and integrons：capture and spread of genes by site-specific recombination [J]. Mol Microbiol，1995，15（4）：593-600.

[4] Seputienv，Povilonisj，Ruzaukasm，et al.Prevalence of trimethoprim resistance genes in Escherichia coli isolates of human and animal origin in Lithuania[J].J Med Microbiol，2010，59 （Pt3）：315-322.

[5]李晓娜，张金宝，王桂琴.整合子-基因盒介导细菌耐药基因水平传播的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医科技版，2015（01）：47-49.

[6] Partridgesr，Tsafnatg，Colerae，et al. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons[J].FEMS Microbiol Rev，2009，33（4）：757-784.

[7]王小娇.污水厂耐耐β-内酰胺类抗生素乳糖发酵型肠杆菌耐药基因的研究[D].上海：华东师范大学，2010.

（责编：张宏民）