低色素高产普鲁兰多糖生产菌株的筛选

张雪亮

（浙江顺风海德尔有限公司，浙江金华322100）

低色素高产普鲁兰多糖生产菌株的筛选

张雪亮

（浙江顺风海德尔有限公司，浙江金华322100）

本研究对短梗霉3.4580菌株用紫外线照射处理，获得变异菌种PL052的糖耐受浓度提高到15%，多糖最高产量在108g/L，且发酵液无色素或色素淡化。通过对变异菌种PL052进行遗传稳定性试验，结果显示，该菌株遗传稳定，可望应用在工业化生产中。

普鲁兰多糖；紫外线；低色素；高产

普鲁兰多糖（Pullulan），是出芽短梗霉属（Aureobasidium pullulans）的微生物利用糖质原料发酵产生的细胞外多糖，因此又名短梗霉多糖。该多糖易溶于水，无毒、无味，可食用；具有优良的可塑性、成膜性，其制成的薄膜隔气性好，在自然界可被微生物降解，不会引发环境污染，故被誉为无公害塑料。由于其独特的物理化学性质和生物特性，使其在应用中具有其他产品无法替代的优点，在医药、食品、化妆品和农药等行业具有广泛的用途。

2006年5月19日，国家卫生部发布了第8号公告，普鲁兰多糖为新增4种食品添加剂产品之一，国内企业纷纷介入。尤其2012年毒胶囊事件的爆发，欧美发达国家对动物性来源的原料担忧，普鲁兰多糖替代明胶做胶囊成了一个首选。但现有普鲁兰多糖菌种产率低，且出芽短梗霉会分泌黑色素，这种物质会牢固地粘附在普鲁兰多糖上，很难用一般方法除去，限制了普鲁兰多糖的工业化规模生产。

本研究现通过对短梗霉3.4580菌株用紫外线照射处理，获得一株产色素少且糖的产量较高的突变株，为下一步工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

出芽短梗霉3.4580，购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 培养基

①斜面，麦芽汁琼脂；②种子培养基[蔗糖5%，酵母膏0.25%，（NH4）2SO40.05%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 0.1%]，pH 6.0，121℃，灭菌30min；③发酵培养基[蔗糖15%，酵母膏0.3%，（NH4）2SO40.05%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 0.1%]，pH 6.0，121℃，灭菌30min。

1.3 培养方法

①斜面培养，保温箱28～30℃，培养72h；②种子培养条件，250mL三角瓶装种子培养基50mL，接斜面种子一环，28～30℃ 220rpm摇床培养24h；③发酵培养条件，250mL三角瓶装发酵培养基50mL，接种量为5%，28～30℃ 280rpm摇床培养3d。

1.4 细胞生长的测定

量取发酵液，1万rpm离心30min，上清液倒出测定多糖含量，沉淀的菌体用蒸馏水洗涤3遍后，在105℃烘干后称重。以细胞干重表示细胞生长。

1.5 发酵液粗多糖含量的测定

准确吸取上述测定细胞生长的上清液，加入2倍体积的乙醇，充分混合均匀，再静置5min左右沉淀多糖。4 000rpm离心10min，小心倾出上清液，得多糖沉淀，用乙醇洗涤3次，70℃干燥至恒重，即为普鲁兰多糖粗品，称重计算产量。

1.6 孢子悬浮液的制备

将斜面菌种转入液体培养基中，28℃ 220rpm活化24h，再转接培养12～16h，达到对数期，镜检涂片分布大量酵母状孢子时，放入装有玻璃珠的三角瓶剧烈振荡10～15min，打碎孢子团快，用脱脂棉过滤。血球计数板计数，用无菌生理盐水调整孢子浓度到约106个/mL。

1.7 诱变处理

取上述悬浮液5mL于平板上，将平板置于紫外灯下30cm处，打开紫外灯，各平板分别照射不同时间后，放入30℃的培养箱中培养，检测紫外线照射处理的致死率，将长出的菌落移接于麦芽汁固体斜面上。待斜面培养成熟后，转接入三角瓶发酵培养基中，摇瓶发酵检测多糖产量，筛选高产菌株。

2 结果与分析

2.1 诱变结果

出芽短梗霉菌株具有复杂的生活周期，在其生长过程中细胞形态常有如下5种变化：酵母状、芽孢子、肿胀孢子、菌丝体和厚垣孢子。一般取酵母状孢子对紫外线较敏感。在实际试验中，通常采用照射距离为30cm。3.4580菌株按上述方法制备孢子悬浮液，用30W紫外灯照射后，各平板共挑选出突变株168株，经筛选有16个株多糖产量有不同程度的提高。检测致死率和正突变率列于表1。表1结果显示，照射时间越长，致死率越高；照射时间对正突变率的影响没有明显的规律。

表1 紫外线照射诱变的结果

2.2 出发菌株和变异菌株的菌落特征比较

菌落特征反映了菌株的性能，菌落大小体现了菌体繁殖速度与多糖产量的高低，以大者为优。发酵液颜色与菌落颜色基本一致，菌落颜色浅，发酵液颜色也浅，以乳白色为优。采用观察菌落特征的方法筛选多糖产量高而色素低的优良菌株，大大简化了菌种筛选的步骤，缩短了筛选时间。

出发菌株3.4580在麦芽汁固体培养基上生长48h后，菌落中央开始出现黑色绒毛状菌丝，摇瓶培养也在同一时间培养液变成绿黑色；而诱变而来的菌株PL052在麦芽汁固体培养基上培养6～7d后才产生灰黑色孢子，摇瓶培养中都末见有黑色素出现，PL052在摇瓶培养过程中，发酵液一直呈现黄白色。出发菌株3.4580的糖耐受浓度只有5%，多糖产量只有10～20g/L,而PL052的糖耐受浓度大大提高，初始糖浓度可达15%，多糖产量100g/L左右，生产效率提高明显。与出发菌株3.4580相比，突变菌株PL052的菌落明显大于出发菌种。

2.3 诱变菌株的遗传稳定性分析

将诱变菌株PL052连续传代培养，共20代，取第5、10、15、18和20代作摇瓶多糖发酵试验，结果诱变菌株PL052的发酵液最终颜色为黄白色，多糖产量维持在83～108g/L，最高产量为108g/L。由此可见，诱变菌株PL052是稳定的。

3 结论

出发菌株3.4580的多糖产量在10～20g/L，糖耐受浓度为5%，通过紫外线诱变，获得的变异菌株PL052的糖耐受浓度提高到15%，多糖产量稳定在83～108g/L，且无色素或色素淡化，说明诱变效果显著，多糖生产效率提高幅度较大。诱变菌株PL052经连续传代培养，结果显示，该菌株遗传稳定，具有在工业化生产中应用的潜力。

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[7]朱永强.短梗霉多糖菌的诱变筛选和发酵工艺[D].武汉:湖北工业大学,2010.

Screening of Low Pigment and High Producing Pullulan Production Strain

Zhang Xue liang
(Zhejiang Shunfeng Haider Limited Company,Zhejiang Jinhua322100)

Ultraviolet irradiation treatment of A ureobasidium pullulans 3.4580 strain,A mutants strain PL052 was obtained,which the sucrose tolerance concentration was increased to 15%,The highest producing of pullulan was 108g/L,and the fermentation solution had no pigment or hypopigmentation.Through the genetic stability test of the mutant strain PL052,The results showed that the genetic stability of the strain could be used in industrial production.

pullulan;UItraviolet;low pigment;High yield

TQ920.1

A

2096-0387（2016）06-0027-03

张雪亮（1970-），男，浙江东阳人，大专，工程师，研究方向：生物发酵。