FOXA1对人乳头状甲状腺癌细胞增殖与细胞周期的影响及其机制探讨

王月娥,王春玉(肥城矿业中心医院，山东泰安7608；中国医科大学)



FOXA1对人乳头状甲状腺癌细胞增殖与细胞周期的影响及其机制探讨

王月娥1,王春玉2(1肥城矿业中心医院，山东泰安271608；2中国医科大学)

摘要：目的观察叉头框蛋白A1(FOXA1)对人乳头状甲状腺癌TPC1细胞增殖及细胞周期的影响，并探讨其机制。方法培养TPC1细胞，分为两组，分别转染Flag-vector(空载体组)及Flag-FOXA1(FOXA1组)。转染12、24、36 h时，采用MTT法检测两组细胞增殖活性。转染24 h后，采用流式单染细胞术检测细胞周期，采用Real-time PCR法检测细胞周期调控蛋白27(p27 Kip1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1) mRNA的表达，采用Western blot法检测p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1 蛋白的表达。结果与空载体组比较，FOXA1组细胞增殖率增加,G1期细胞比例减少，而S期细胞比例增加(P均<0.05)。与空载体组比较，FOXA1组p27 Kip1 mRNA及蛋白表达降低，CDK2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达增加(P均<0.05)。结论FOXA1可促进TPC1细胞增殖，使S期细胞增加，其机制可能与下调p27 Kip1及上调CDK2、CyclinD1表达有关。

关键词：叉头框蛋白A1；细胞增殖；细胞周期；甲状腺癌

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤[1]。其中以乳头状甲状腺癌最常见，预后较好[2]。乳头状甲状腺癌的病因目前尚不清楚，研究与乳头状甲状腺癌发病有关的基因具有重要意义。叉头框蛋白(FOXA)家族是肝脏特异性转录因子家族[3]，包括FOXA1、FOXA2、FOXA3[4]。其中，FOXA1参与上皮向间质转化[5]以及肝、肺、前列腺、胰腺的发育[6]，对乳腺导管形成至关重要[7]。研究发现，FOXA1参与调节肺癌、脑肿瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌的发生过程[4]。FOXA1被认为是核激素受体信号转导过程中的关键因子[8],但FOXA1在乳头状甲状腺癌发病中的作用尚不明确。2014年4月，我们采用脂质体转染技术将FOXA1转染人乳头状甲状腺癌TPC1细胞，观察对细胞增殖及细胞周期的影响，并探讨其机制。

1材料与方法

1.1细胞及试剂TPC1细胞为本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态、TRIzol、反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM购自宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒购自普洛麦格生物有限公司；Protein marker、Lipofectimine2000、高糖DMEM、胎牛血清、ECL发光试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；Flag抗体购自上海睿星生物技术有限公司；细胞周期调控蛋白27(p27 Kip1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)购自Cell Signaling公司；HRP标记的羊抗鼠/兔IgG购自北京中杉金桥公司；引物合成、DNA测序由北京华大基因公司完成。

1.2细胞转染与分组采用脂质体转染技术。用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养TPC1细胞，胰蛋白酶消化后，将TPC1细胞铺于6孔板。待细胞融合达到80%时，按照Lipofectimine2000转染说明书，将Flag-vector(空载体组)及Flag-FOXA1(FOXA1组)分别瞬时转染到TPC1细胞中。24 h后收集两组细胞，提取蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白免疫印记检测示FOXA1蛋白表达，表明FOXA1组Flag-FOXA1真核表达质粒在TPC1细胞中表达，FOXA1转染成功。

1.3细胞增殖活性检测采用MTT法。转染24 h后，胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM重悬，按4×103/孔接种于96孔培养板，每孔200 μL，分别培养12、24、36 h后，每孔加MTT液10 μL，继续培养4 h，每孔加DMSO 200 μL，酶标仪490 nm处测定各孔的吸光度值(OD值)。增殖率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4细胞周期检测采用流式单染细胞术。转染24 h后，用0.25%胰蛋白酶将两组细胞消化成单细胞悬液，以含10%胎牛血清的DMEM培养基终止胰酶消化，离心5 min，预冷PBS清洗1遍，加入预冷70%乙醇，4 ℃固定过夜，离心收集细胞，加入500 μL含50 μg/mL溴化乙锭(PI)的PBS(含有100 μg/mL RNase A和0.1% Triton X-100)，室温避光作用30 min，流式细胞仪检测两组细胞周期。

1.5细胞周期相关基因表达检测采用Real-time PCR法。转染24 h后，提取细胞总RNA。取1 μg样品RNA进行反转录。应用Primer Premier 5设计，FOXA1上游5′-GCAATACTCGCCTTACGGCT-3′，下游5′-GTGTTTAGGACGGGTCTGGA-3′；p27上游5′-TGCAACCGACGATTCTTCTAC-3′，下游5′-TCCT-TGCTTCATCAAGCAGTG-3′；CDK2上游5′-TGTGGC-GCTTAAGAAAATCC-3′，下游5′-CCAGCAGCTTGAC-GATGTTA-3′；Cyclin D1上游5′-GGATGCTGGAGGT-CTGCGA-3′，下游5′-AGAGGCCACGAACATGCAA-3′；GAPDH上游5′-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3′，下游5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′。PCR反应液为20 μL，反应液配置在冰上进行，反应程序：95 ℃ 1 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s，40个循环，检测p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1 mRNA的表达。

1.6细胞周期相关蛋白检测采用Western blot法。在空载体组、FOXA1组中分别加入100 μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上放置，收集所有液体；超声破碎仪破碎细胞2次，离心30 min后，将上清转移到新的离心管中，G250考马斯亮蓝方法进行蛋白定量。取40 μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离，4 ℃ 40 V恒压将蛋白质转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。使用Flag标签抗体、GAPDH、p27、CDK2、Cyclin D1作为一抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠/兔(1∶5 000)稀释二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，进行ECL显影。GAPDH作为内参，检测p27、CDK2、 CyclinD1蛋白表达。

1.7统计学方法应用SPSS17.0统计软件。非正态分布数据以中位数表示，组间比较采用秩和检验。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组细胞增殖率比较空载体组12、24、36 h时增殖率分别为43.7%、51.2%、65.2%，FOXA1组分别为47.6%、75.4%、95.6%，FOXA1组24、36 h时的增殖率均高于空载体组(P均<0.05)。

2.2两组细胞周期结果空载体组G1、S期细胞比例分别占80.74%、13.93%，FOXA1组分别为71.47%、20.02%，FOXA1组G1期细胞减少，而S期细胞比例增加(P均<0.05)。

2.3两组细胞周期相关基因表达空载体组各细胞周期相关基因表达均为1，FOXA1组p27、CDK2、 Cyclin D1 mRNA分别为0.524、1.584、1.825，FOXA1组p27 Kip1 mRNA表达降低，CDK2、Cyclin D1 mRNA表达增加(P<0.05)。

2.4两组细胞周期相关蛋白表达FOXA1组p27 Kip1蛋白表达降低，CDK2、Cyclin D1表达增加。见图1。

注：1为空载体组，2为FOXA1组。

图1两组p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1蛋白表达

情况(Western blot法)

3讨论

FOX家族有17个亚家族，总成员超过100个，广泛参与胚胎形成、细胞生长分化、发育、代谢、免疫、细胞周期调控等多种生物学过程[9,10]。近年研究发现，FOX家族与肿瘤发生发展关系较密切，其中FOXA1与肿瘤的关系最密切。

FOXA1基因位于人染色体14q21.1位点，其结构包括N端的转录激活域、中间与DNA结合的FOX域以及C端与组蛋白h1/H4相关的激活转录结合域[11]。FOXA1可通过取代组蛋白H1及二甲基化h1赖氨酸4和DNA基因组去甲基化，从而松解与之相结合的致密染色质区域并促进转录，因此被称为先锋因子[12]。FOXA1在乳腺、食管、肝脏、胰腺、膀胱、前列腺、结肠和肺组织中均有表达[13]，参与代谢过程、信号调节、细胞周期相关基因的启动，并且与肺癌、食管癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤的发病机制密切相关[12]。

细胞周期作为基本的生物学功能之一，分为间期与分裂期，间期又分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)，M期为细胞分裂期。其G1/S、S期及G2/M期检查点影响着细胞周期进程、增殖及细胞化疗敏感性[14]。本研究发现，FOXA1促进人乳头状甲状腺癌TPC1细胞增殖活性，与空载体组比较，FOXA1组G1期细胞减少，而S期细胞增加，提示FOXA1能够加速TPC1细胞周期进展，使G1期细胞减少、S期细胞增多，因此FOXA1对细胞进程有影响。

p27基因是调控细胞周期并抑制细胞分裂的重要基因，其定位于12p13，其编码的蛋白质含有198个氨基酸，分子量约为27 kD。p27基因是细胞周期抑制子，在癌细胞中能够促进细胞调亡、抑制细胞增殖和诱导分化，而在良性肿瘤和恶性肿瘤中p27蛋白表达降低。Gardner 等[15]研究发现，p27 可通过抑制CDK2的活性，从而阻滞细胞周期。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是一类关键的细胞周期调控蛋白酶，该酶的活化与钝化维持着细胞周期各时相有序进行。CDK2是完成G1期和进入S期一个非常关键的细胞周期蛋白依赖性激酶，参与调控细胞生长过程中多个信号通路的整合[1]。Cyclin D1是调控细胞周期G1期的关键蛋白，其表达增高与肿瘤的发生有关。本研究结果发现，FOXA1组p27 Kip1 mRNA及蛋白表达降低，CDK2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达增加，提示p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达变化与FOXA1促进细胞增殖活性和细胞周期相关。

综上所述，FOXA1可提高人乳头状甲状腺癌TPC1细胞增殖活性，使S期细胞增加，其机制可能与下调p27 Kip1及上调CDK2、Cyclin D1表达有关。

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Effects of FOXA1 on proliferation and cell cycle of human papillary thyroid carcinoma cells

WangYuee1,WangChunyu

(1FeichengMiningGroupCentralHospital,Taian271608,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of forkhead box protein A1 (FOXA1) on the proliferation and cell cycle of human papillary thyroid carcinoma TPC1 cells and to investigate its mechanism. MethodsTPC1 cells were divided into two groups which were separately transfected with Flag-vector (empty vector group) and Flag-FOXA1 (FOXA1 group). The proliferation activity of the two groups of TPC1 cells was detected by MTT method after transfection for 12 h, 24 h and 36 h, and cell cycle was detected by flow cytometry at 24 h. The mRNA and protein expression of p27 Kip1, cyclin-dependent kinase (CDK2) and CyclinD1 was detected by real-time PCR and Western blotting at 24 h after transfection of Flag-FOXA1. ResultsIn the FOXA1 group, the cell proliferation was promoted, cells in the G1 phase decreased, but cells in the S phase increased. Compared with the empty vector group, the expression of p27 Kip1 mRNA and protein was decreased and the expression of CyclinD1 and CDK2 mRNA and protein was increased. Conclusions FOXA1 can promote the cell proliferation and increase the cells in the S period. The mechanism may be related to the down-regulation of p27 Kip1 and up-regulation of CDK2 and CyclinD1 expression.

Key words:forkhead box protein A1; cell proliferation; cell cycle; thyroid carcinoma

(收稿日期：2015-11-04)

中图分类号：R736.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)14-0011-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.004

第一作者简介：王月娥(1978-)，女，主治医师，学士，主要研究方向为甲状腺肿瘤发病机制与治疗。E-mail: wangyuee1978@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31401115)。