血管内皮生长因子及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与鼻咽癌患者临床分期及预后的相关性

陈　彤

(甘肃省人民医院 耳鼻咽喉头颈外科, 甘肃 兰州, 730000)



血管内皮生长因子及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与鼻咽癌患者临床分期及预后的相关性

陈彤

(甘肃省人民医院 耳鼻咽喉头颈外科, 甘肃 兰州, 730000)

摘要:目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)与鼻咽癌患者临床分期及预后的相关性。方法选择鼻咽癌患者50例及体检健康者50例。采集鼻咽癌患者的鼻咽癌组织、癌旁正常组织以及血清标本，检测血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD的含量以及鼻咽癌组织、癌旁正常组织中mTOR、核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(P70S6)、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)的mRNA含量。结果鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量显著高于健康志愿者(P<0.05); TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴结转移的鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量显著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴结未转移鼻咽癌患者(P<0.05)。鼻咽癌组织中mTOR、P70S6、4EBP1的表达量显著高于癌旁正常组织(P<0.05); TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴结转移的鼻咽癌组织中mTOR、P70S6、4EBP1的表达量显著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴结未转移的鼻咽癌组织(P<0.05)。结论鼻咽癌患者血清中VEGF含量异常升高，肿瘤组织中mTOR表达量异常增加，VEGF及mTOR异常与TNM分期、病理分级以及淋巴结转移相关。

关键词:鼻咽癌; 血管内皮生长因子; 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白; 淋巴结转移

鼻咽癌是中国耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤之一，其特征是较早发生颈部淋巴结转移。鼻咽癌的发病机制仍未完全阐明，早期诊断也较为困难[1]。血管内皮生长因子(VEGF)是一类与血管和淋巴管新生相关的分子，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是与细胞生长和增殖密切相关的分子。本研究探讨VEGF及mTOR与鼻咽癌患者临床分期及预后的相关性，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2012年5月—2014年5月在本院确诊为鼻咽癌的患者50例，男34例，女16例，年龄38～65岁，平均(51.24±5.32)岁；角化鳞状细胞癌8例，非角化鳞状细胞癌31例，未分化癌11例; TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期10例，Ⅳ期13例。另选取50例健康体检者为对照。

1.2研究方法

鼻咽癌患者于术前采集外周血5 mL, 健康志愿者于体检时采集外周血5 mL, 3 000 r/min离心10 min, 取血清待检。鼻咽癌患者于术中采集鼻咽癌组织和癌旁正常组织，生理盐水清洗后得到组织标本。取出血清标本，采用酶联免疫吸附试剂盒检测VEGFA、VEGFC、VEGFD的含量。试剂购自北京晶美生物工程有限公司。

取出鼻咽癌组织和癌旁正常组织，抽提RNA后反转录得到cDNA，而后进行PCR反应，扩增mTOR、P70S6、4EBP1后计算mRNA含量。具体步骤如下: ① RT-PCR引物设计。参照文献资料，设计mTOR、P70S6、4EBP1引物。Mtor的上游5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG′, 下游5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′; P70S6的上游5′-TACTTCGGGTACTTGGTA A-3′, 下游5’-GATGAAGGGATCCTTTACT-3′; 4EP1的上游5′-ACCGGAAATTCCTGGAG-3′, 下游5′-CCCGCTTATCTTCTGTA-3′; β-actin的上游5′-ACGAGAGAATGGAAAGTCAAA -3′, 下游5′-ATGCTGCTTACATGTCTCGAT-3′。② 总RNA提取。加入1 mL Trizol试剂于25 mL细胞培养瓶中，摇匀静置3～5 min; 将细胞裂解液吸入1.5 mL ET管，加氯仿0.2 mL, 静置2～3 min, 1 200 r/min离心15 min, 取上清液0.6 mL至EP管，加0.5 mL异丙醇，静置10 min; 2 000 r/min离心10 min,，弃上清液，70%乙醇1 mL洗涤, 7 500 r/min离心5 min; 用50 μL无Rnase溶解总RNA。③ RNA浓度测定。吸取RNA溶液，加入DEPC稀释为50 μL, 以DEPC水作参照，读取紫外分光光度计260 nm波长下光密度值，计算mRNA浓度。④ 常规RT-PCR扩增：取1 μg RNA做逆转录模板, Oligo(d)T 1 μL做逆转录引物，加DEPC至12 μL; 75 ℃变性5 min, 冰浴冷却；加入缓冲液4 μL, Rnase抑制剂1 μL, Dntp 2 μL, 37 ℃孵育5 min; 加入AMV逆转录酶1 μL, 37 ℃反转录60 min; 70 ℃终止反应；冰上冷却。⑤ PCR反应条件。PCR反应体系25 μL(Cdna 0.5 μL，上游与下游引物0.25 μL, Taq酶0.2 μL，Dntp 2 μL); RT-PCR扩增条件: 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 30 s; Mtor: 49℃30 s; P70S6K: 52 ℃ 30 s; 4EBP1：55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环, 72 ℃延伸5 min, 4 ℃终止。

2结果

2.1鼻咽癌患者血清中VEGF的含量

鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量显著高于健康志愿者(P<0.05)；TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴结转移的鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量显著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴结未转移鼻咽癌患者(P<0.05)。见表1、2。

表1　健康志愿者与鼻咽癌患者血清中VEGF的

与健康志愿者组比较, *P<0.05。

与Ⅰ/Ⅱ期比较, *P<0.05; 与高/中分化比较, #P<0.05; 与未转移比较, △P<0.05。

2.2鼻咽癌组织中mTOR、P70S6、4EBP1的表达

鼻咽癌组织中mTOR、P70S6、4EBP1的表达量显著高于癌旁正常组织(P<0.05); TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴结转移的鼻咽癌组织中mTOR、P70S6、4EBP1的表达量显著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴结未转移的鼻咽癌组织(P<0.05)。见表3、4。

表3　鼻咽癌组织与癌旁正常组织中mTOR、P70S6、

与鼻咽癌组织比较, *P<0.05。

表4　不同TNM分期、分化程度及淋巴结转移情况的鼻咽组织中mTOR、P70S6、4EBP1含量比较

与Ⅰ/Ⅱ期比较, *P<0.05; 与高/中分化比较, #P<0.05; 与未转移比较, △P<0.05。

3讨论

血管内皮生长因子(VEGF)是一类血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD等多种亚型[2]。研究[3]证实，VEGFA、VEGFC、VEGFD这3种VEGF分子与淋巴管的新生相关。本研究中，鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量显著高于健康志愿者，提示血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量升高与鼻咽癌的发生有关。

VEGFA是功能最为明确的促血管新生的细胞因子，一方面能够与VEGFR1结合来促进内皮细胞分裂和增殖，诱导癌细胞生长和转移；另一方面，其能够与淋巴管上的VEGFR2结合来增加新生淋巴管数目，促进癌细胞发生淋巴转移。VEGFC/D能够与VEGFR2结合来发挥促进淋巴管新生的作用，且由VEGFC/D诱导产生的新生淋巴管具有无瓣膜功能、淋巴清除率低等特点，有利于癌细胞的淋巴转移[4]。本研究探讨VEGF与鼻咽癌病情发展的关系，结果显示TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴结转移的鼻咽癌患者血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量显著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴结未转移的鼻咽癌患者，说明血清中VEGFA、VEGFC、VEGFD含量升高与鼻咽癌的病情发展有关。

鼻咽癌发生淋巴结转移不仅依赖淋巴管的新生过程，同时还需要肿瘤细胞自身不断生长、增殖、分化[5]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是哺乳动物体内一类高度保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，位于PI3K/AKT信号通路下游，主要依靠P70S6和4EBP1来调节细胞生长和增殖相关蛋白的表达[6]。组织对鼻咽癌组织中mTOR及下游P70S6、4EBP1的表达量进行分析，结果显示鼻咽癌组织中mTOR、P70S6、4EBP1的表达量高于癌旁正常组织，TNM Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴结转移的鼻咽癌组织中mTOR、P70S6、4EBP1的表达量高于TNM Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、淋巴结未转移的鼻咽癌组织，提示mTOR通路功能增强与鼻咽癌的发生发展密切相关。

参考文献

[1]武要洪, 李宝忠, 李国萍, 等. 鼻咽癌患者EBV感染与血管生成关系研究[J]. 实用临床医药杂志, 2011, 15(5): 12.

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[6]韩艳艳, 李芳. 鼻咽癌组织中PI3K、mTOR的表达及临床意义[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2012, 19(5): 252.

Correlation between vascular endothelial growth factor,mammalian target of rapamycin and clinical stage,prognosis in patients with nasopharyngeal carcinoma

CHEN Tong

(DepartmentofE.N.T. &H.N.Surgery,GansuProvincialPeople′sHospital,Lanzhou,Gansu, 730000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the correlation between vascular endothelial growth factor (VEGF), mammalian target of rapamycin (mTOR) and clinical stage, prognosis in patients with nasopharyngeal carcinoma. MethodsFifty patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) and fifty healthy volunteers were selected. Nasopharyngeal tissues, adjacent normal tissues and serum samples of NPC patients were collected. Serum VEGFA, VEGFC, VEGFD contents and mRNA contents of mTOR, P70S6, 4EBP1 in nasopharyngeal tissues, adjacent normal tissues were detected. ResultsSerum VEGFA, VEGFC and VEGFD contents in NPC patients were significantly higher than those in the healthy volunteers (P<0.05). Serum VEGFA, VEGFC, VEGFD contents in NPC patients with TNM Ⅲ/Ⅳ stage, low/undifferentiated, lymph node metastasis were significantly higher than those in NPC patients with TNM Ⅰ/Ⅱ stage, medium/high differentiated, without lymph node metastasis nasopharyngeal carcinoma (P<0.05). Expressions of mTOR, P70S6 and 4EBP1 in nasopharyngeal carcinoma tissue were significantly higher than those in the adjacent normal tissues (P<0.05), and mTOR, P70S6, 4EBP1 expressions in nasopharyngeal carcinoma tissues featured by TNM Ⅲ/Ⅳ stage, low/undifferentiated, lymph node metastasis were significantly higher than those in nasopharyngeal carcinoma tissues featured by TNM Ⅲ/Ⅳ stage, low/undifferentiated, lymph node metastasis (P<0.05). ConclusionSerum VEGF level and mTOR expression increase abnormally in patients with nasopharyngeal carcinoma and tumor tissue respectively, and VEGF and mTOR abnormalities are correlated with TNM stage, histological grade and lymph node metastasis.

中图分类号:R 739.63

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)07-058-03

DOI:10.7619/jcmp.201607017

收稿日期:2015-12-23

KEYWORS: nasopharyngeal carcinoma; vascular endothelial growth factor; mammalian target of rapamycin; lymph node metastasis