洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡禽内源性反转录病毒基因检测与分析

李拓凡　梁雄燕　叶丽珣　万亮　杨玉莹

摘要：为了解禽内源性反转录病毒（AERs）在湖北地方鸡种洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组中的存在状况，利用禽内源性反转录病毒EAV、ev loci和ev/J特异性引物对两种鸡的基因组进行PCR检测。结果表明。洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡中均检测出EAV、ev loci和ev/J三种禽内源性反转录病毒基因序列：核酸序列同源性分析显示，洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组中的EAV、ev loci和ev/J之间的同源性分别为98.8%，99.6%和99.6%；进化树分析显示，两种鸡内的三种禽内源性反转录病毒均分别位于进化树的同一分支，表明洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡内源性反转录病毒具有共同的祖先并且进化路径相似。洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡的ev/J与ALV-J原型株HPRS-103同源性高于98%，且进化树处于同一分支。而与ALV-J国内分离株SD9901、YZ9901毒株的同源性较低，并且进化树位于不同分支，表明这两种鸡的ev/J可能与ALV-J原型株HPRS-103亲缘关系更近，而与国内的外源性ALV-J分离毒株SD9901、YZ9901亲缘关系较远。

关键词：禽内源性反转录病毒：ev loci：ev/J

禽内源性反转录病毒（Avian endogenous retrovirus，AERs）是一类存在于鸡基因组中，随宿主基因组遗传复制的前病毒DNA序列。在外源性J亚群禽白血病病毒（ALV-J）出现以前，禽内源性反转录病毒一直未引起人们重视，直到发现ALV-J囊膜基因与鸡基因组中内源性反转录病毒ev/J部分序列高度同源，人们才逐渐意识到禽内源性反转录病毒可能参与了外源性禽白血病病毒新亚群的形成，是外源性ALV-J形成的重要物质基础。然而，禽内源性反转录病毒在中国地方鸡种鸡群中的存在状况尚不清楚，本研究采用特异性引物对湖北省两个地方品种鸡群进行禽了内源性反转录病毒PCR检测与分析，旨在了解这两种鸡种基因组中禽内源性反转录病毒的相关状况，为进一步探索内源性禽反转录病毒与外源性病毒的传播、进化、致病机理的相关性等提供一定的基础数据和理论依据。

1.材料与方法

1.1主要材料与试剂

洪山鸡、麻城绿壳蛋鸡种蛋分别购自随州市谭龙畜禽开发有限公司洪山鸡保种场、麻城绿壳蛋鸡原种保种场：M199细胞培养液和胎牛血清为Hyclone公司产品；PCR相关试剂和PMD19T-Vector购自宝生物工程（大连）有限公司：琼脂糖凝胶回收试剂盒为北京鼎国昌盛公司产品：DM2000PlusDNA Marker为北京康为世纪生物公司产品：引物参照相关文献及Genebank相关序列设计，均由上海捷瑞生物公司合成，各引物序列相关信息见表1。其中H5/H7，F2/R2，F5/R5为检测引物，扩增片段不测序。

1.2模板DNA提取

分别取洪山鸡（缩写为HS）和麻城绿壳蛋鸡（缩写为ML）的10日龄鸡胚进行原代鸡胚成纤维细胞培养，待细胞长满单层，取每个品种鸡细胞各一瓶，分别收集细胞，用SDS法提取基因组DNA，用ALV-J特异性引物H5/H7进行PCR检测，无外源性ALV-J感染的基因组DNA作为扩增禽内源性反转录病毒基因的DNA模板。

1.3PCR反应体系及条件

PCR均采用25μL反应体系：10xPCR Buffer2.5μL，Mg²⁺2μL，dNTP2 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，Ex Tag 0.25μL，加去离子水H₂O至25μL。PCR循环条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火30 s（不同引物对应的退火温度见表1），72℃延伸1～2 min（延伸时间，按Taq酶效率1 kb/min计算），共33个循环：72℃10min，4℃10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。

1.4目的片段的克隆与测序

用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物并与pMDTM19-T Vector连接，转化DH5a感受态细胞，涂布氨苄青霉素平板，筛选阳性克隆菌，用M13通用引物对转化菌进行进行PCR鉴定，送武汉擎科创新生物科技有限公司测序。

1.5序列分析

测序结果用核酸分析软件DNAStar进行分析，所引用的相关基因序列均来自NCBI GenBank：EAV-0（X59844）；ev loci：Clonel（AY013303）；Clone3（AY013304）；Clone6（AY013305）；ev/J：EAV-HP （NC005947）；ALV-J：HPRS-103（Z46390），SD9901（AY897220），YZ9901（AY897222）。

2.结果与分析

2.1模板DNA提取及外源性ALV-J感染排除

以特异性引物H5/H7对所提取的洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡DNA进行外源性ALV-J PCR扩增，电泳检测显示阳性对照扩增出ALV-J对应的片段，本试验所提取的DNA未扩增出片段，如图1所示。

2.2洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组内禽反转录病毒PCR检测

分别以洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组DNA为模板，分别用禽反转录病毒EAV、ev loci、ev/J特异性引物进行PCR扩增，结果洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡均检测出与EAV、ev loci、ev/J对应的目标片段（图2和图3）。依据DNA模板及所使用的引物将从洪山鸡基因组中扩增出的禽内源性病毒反转录片段依次命名为HS1、HS2、HS3、HS4、HS5、HS6；将从洪山鸡基因组中扩增出的禽内源性病毒反转录片段依次命名为ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6。

2.3目的片段克隆与测序结果

将筛选的洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组内禽反转录病毒各片段阳性克隆菌送武汉擎科生物技术公司测序，得到HS1、HS3、HS4、HS6片段的大小分别为241、881、713、1 479 bp；MLl、ML3、ML4、ML6的大小分别为241、881、713、1 479 bp。

2.4EAV核酸序列分析

测序结果DNAStar分析显示，洪山鸡与麻城绿壳蛋鸡的EAV中TM（跨膜糖蛋白单位）、LTR（长末端重复序列）基因之间区域的核酸序列（EAV-HS、EAV-ML）同源性为98.8%，而二者与EAV-0内源性序列的相应区域同源性分别为98.3%和99.6%：与E51内源性序列的同源性分别为74.7%和75.9%（图4）。进化树分析显示，EAV-HS、EAV-ML与EAV-0处于同一分支而与E51处于不同的分支（图5）。

2.5ev loci核酸序列分析结果

DNAStar分析显示，洪山鸡与麻城绿壳蛋鸡基因组中ev loci的env基因之间的同源性为99.6%，而二者与原型株Clonel，Clone3，Clone6核酸同源性在98.6%-99.0%之间（图6）。进化树分析显示eyHS、ev-ML处于同于分支，而与三个原型株处于不同的分支（图7）。

2.5 ev/J核酸序列分析结果

洪山鸡与麻城绿壳蛋鸡中ev/J的env基因部分核酸序列之间同源性为99.6%，与EAV-HP相应区域的核酸同源性分别为98.5%、98.9%：与外源性ALV-J原型株HPRS-103及SD9901、YZ9901分离株的同源性为95.5%-98.1%（图8）。进化树分析显示，ev/J-HS、ev/J-ML与ALV-J原型株HPRS-103处于进化树同一分支，而与外源性ALV-J的SD9901、YZ9901处于不同分支（图9）。

3.讨论

禽内源性反转录病毒（Avian Endogenous Retrovirus，AERs）是一类存在于鸡基因组中，随宿主基因组遗传复制的前病毒DNA序列，是外源性禽白血病病毒早期感染留下的“内影像”。在外源性J亚群禽白血病病毒（ALV-J）出现以前，禽内源性反转录病毒一直未引起人们重视，直到发现ALV-J的env基因与禽内源性反转录病毒ev/J（EAV-HP）的eny序列具有高达96%的同源性后，人们才逐渐意识到禽内源性反转录病毒的重要性。当前的研究结果表明，外源性的ALV-J可能是内源性ev/J与其他外源性ALV发生重组产生的新的亚群，禽内源性反转录病毒可能是外源性禽白血病新亚群形成的重要物质基础。

本研究利用特异性PCR引物对湖北省地方品种洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡基因组进行了部分禽内源性反转录病毒检测。结果表明，2个品种的鸡基因组中均检测到ev loci、ev/J、EAV 3种禽内源性反转录病毒。核酸序列同源性分析显示这两种鸡中的禽内源性反转录病毒EAV、ev loci座、ev/J均具有高度同源性，分别为98.8%、99.6%、98.5%；进化树分析显示，在相应的病毒进化树中两种鸡的3种禽内源性反转录病毒均分别处于同一分支。这可能提示，洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡内源性反转录病毒具有共同的祖先并且进化路径相似。

另外，洪山鸡和麻城绿壳蛋鸡的ev/J与原型株HPRS-103同源性高于98%，且进化树处于同一分支。而与国内SD9901、YZ9901毒株的同源性只有95%，并且进化树也不处于同一分支，结果表明这2种鸡以前所感染的外源性病毒与原型株HPRS-103关系密切，而与国内的一些分离毒株存在一定的差异。