超高压提取女贞子总三萜工艺条件的优化

王雪竹,吴顺红,赵光远

(1.河南省食品药品审评查验中心;2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州　450000)



超高压提取女贞子总三萜工艺条件的优化

王雪竹1,吴顺红2,赵光远2

(1.河南省食品药品审评查验中心;2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州450000)

摘要：目的优化超高压提取女贞子总三萜的工艺条件，并且同回流提取和超声提取方法进行比较。方法以女贞子为原料, 总三萜得率为指标，采用单因素试验和正交试验，从粉碎度、超高压压力、时间、固液比(g∶mL)四个方面对提取的工艺条件进行优化。结果最佳工艺条件为：粉碎度60目、压力400 MPa、 提取4 min、 固液比1∶15。在最佳的条件下，总三萜的得率为6.08%，回流提取和超声提取的得率分别为5.82%和5.68%。结论超高压提取方法较回流提取和超声提取的得率高，且提取时间短，是女贞子总三萜提取的适宜方法。

关键词：女贞子；总三萜；超高压提取；工艺优化

女贞子为木犀科植物女贞(LigustrumlucidumAit)的干燥成熟果实[1]。女贞子中含有三萜类、黄酮类、多糖类、醚萜类等多种活性成分[2-5]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等功能作用[6-9]。三萜类化合物是女贞子中主要的活性成分[10-12]。因此，提取女贞子中三萜成分对开发利用女贞子具有重要意义。

潘晴等[13]用80%的乙醇回流，石油醚萃取从石油醚部分中鉴定了齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、19α-羟基-3-乙酰乌索酸三个成分；张静等[14]采用超声提取的方法，通过单因素试验和正交试验考察了超声提取对女贞子三萜类化合物的影响。但微波提取和超声提取易造成部分成分的破坏。近年来，超高压提取方法在天然产物的功能成分提取上得到应用，其提取时间短、提取得率高[15-18]。但采用超高压提取女贞子总三萜，目前还少见报道。正交实验法是天然产物提取工艺中较好的工艺优化方法[19-20]，本研究拟采用超高压提取女贞子总三萜，对其提取工艺进行正交实验优化，并且同回流提取和超声提取方法进行比较，以期为女贞子资源的利用提供理论支撑。

1材料

女贞子于2015年12月采自郑州，由郑州轻工业学院纵伟教授鉴定为木犀科植物女贞(LigustrumlucidumAit. )，干燥粉碎后备用；UHP900×2-Z超高压处理装置，购自包头科发公司；R-205 型旋转蒸发仪，购自上海申胜生物技术有限公司。乙醇、乙酸乙酯等为分析纯。

2方法与结果

2.1女贞子总三萜超高压提取 女贞子粉碎后加入一定量的无水乙醇，混匀后装入聚乙烯塑料袋，双层封口后放入超高压容积腔中，超高压处理一定时间后取出，剪开塑料袋，提取液过滤，真空浓缩，加水混匀后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空浓缩后再干燥至恒重，得女贞子总三萜粗提取物，然后测定其中的总三萜含量，计算其中女贞子总三萜质量。按下式计算女贞子总三萜的得率。

女贞子总三萜的得率(%)=女贞子总三萜/女贞子质量×100%

2.2总三萜含量的测定采用薄层色谱分离—紫外分光光度法测定女贞子总三萜含量。首先配制 1.00 g·L-1的熊果酸标准品甲醇溶液，依次量取0、20、40、60、80、100 μL的熊果酸甲醇溶液，在将经活化的0.5%(w/v)羧甲基纤维素钠—硅胶G薄板分成左右二个区域，在其中一个区域上点样，同时在另外一个区域点上相同的溶液作为对照，然后在层析缸中以甲醇∶氯仿=3∶1为展开剂展开，展开后挥干溶剂，在对照样的相应的部分喷10%(v/v)硫酸乙醇，然后放在烘箱中，以105℃显色10 min，对照样显色后刮取于红紫色部分相对应的样品样部分的相应条带，以甲醇为溶剂进行浸泡2 h ,5 000 r·min-1离心15 min后收集上清，85℃水浴蒸干甲醇，然后加0.3 mL的5%(w/v)香草醛冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，在60℃下反应15 min,然后冰水冷却，加5 mL冰醋酸，在542 nm测定反应液的吸光度，绘制吸光度和三萜含量的标准曲线(图1)。该标准曲线线性方程为：Y=0.004 3X+0.005，其中X为含量(μg)，Y为吸光度，R2=0.999。

图1　三萜化合物标准曲线

2.3超高压提取单因素试验选择粉碎度、超高压压力、保压时间、固液比(g∶mL)四个因素进行单因素试验，在固定三个因素水平的前提条件下，对剩余一个影响因素进行单因素研究，其固定条件为：粉碎度60目、压力400 MPa、时间4 min、固液比1∶15(g∶mL)。

2.3.1粉碎度对总三萜得率的影响在超高压压力400 MPa、保压时间4 min、固液比1∶15 (g∶mL)的条件下，对不同粉碎度的女贞子进行提取，粉碎度对得率的影响如图2所示。

图2　粉碎度对总三萜得率的影响

在60目前，总三萜得率随粉碎度的增加而增加，但达到60目后，继续增加粉碎程度，得率略有下降。这是因为粉碎度达到一定程度后，继续粉碎，细胞过度破坏，导致大量杂质溶出，影响总三萜溶出。因此，60目粉碎度较适宜。

2.3.2压力对总三萜得率的影响在60目粉碎度、超高压保压时间4 min、固液比1∶15 (g∶mL)的条件下，不同超高压压力对总三萜得率的影响如图3所示。

如图3所示，400 MPa前，总三萜得率随压力的增加而增加，压力高于400 MPa后，总三萜得率随压力增加而略下降。这是因为超高压下，细胞发生形变导致破坏，促进细胞内的有效成分溶出。但压力过大，细胞过度破坏，导致大量杂质溶出，影响总三萜溶出。因此，压力选择400 MPa为宜。

图3　超高压压力对总三萜得率的影响

2.3.3保压时间对总三萜得率的影响在60目粉碎度、400 MPa、固液比1∶15 (g∶mL)的条件下，不同处理时间对总三萜得率的影响如图4所示。

如图4所示，4 min前, 总三萜得率随时间增加而增加，超过4 min后，得率变化较小。这是因为4 min时，已造成女贞子细胞的破坏，继续增加时间，细胞过度破坏，导致大量杂质溶出，影响总三萜溶出。因此，保压时间选择4 min。

图4　保压时间对总三萜得率的影响

2.3.4固液比对总三萜得率的影响在60目粉碎度、400 MPa、保压时间4 min的条件下，不同固液比对总三萜得率的影响如图5所示。

图5　固液比对总三萜得率的影响

如图5所示，1∶15 (g∶mL)前, 总三萜得率随溶剂用量增加而增加，超过1∶15后，得率增加缓慢。这是因为溶剂用量大，女贞子细胞壁内外两侧的三萜化合物浓度差大，有利于其扩散和溶出，但过大的固液比在实际使用中会导致后续的浓缩工序负担较大，因此，固液比选择1∶15。

2.4正交实验优化在单因素的基础上，采用L9(34)正交实验对女贞子三萜的提取工艺进行优化，实验因素与水平表见表1。正交实验结果见表2。由极差R分析可知，各因素对女贞子总三萜得率影响的次序为：超高压压力>粉碎度>保压时间>固液比。最佳提取条件为 A2B2C2D2，即：粉碎度60目、压力400 MPa、时间4 min、固液比1∶15。对表2进行的方差分析结果见表3。从表3可见，粉碎度和超高压压力对女贞子总三萜得率在所考察的范围内影响显著，保压时间和固液比对女贞子总三萜得率在所考察的范围内影响不显著。

2.5工艺验证实验根据正交试验结果筛选的工艺条件进行3批验证试验，以优化工艺作为标准提取总三萜，得率都较高，总三萜得率分别为6.07%、6.08%、6.09%，总三萜得率的平均值为6.08%。试验结果表明，所优化的提取工艺合理可行，且结果稳定可靠。

2.6三种提取方法的比较参照文献[13]进行女贞子总三萜回流提取，取已粉碎好的女贞子 (60目)100.0 g，装入乙醇回流瓶内，加入90%乙醇连续回流120 min，提取液过滤，真空浓缩，加水混匀后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空浓缩后再干燥至恒重，得回流提取的女贞子总三萜。

参照文献[20-21]进行女贞子总三萜超声提取，取已粉碎好的女贞子 (60目)10.0 g，加入100 mL 90%乙醇的乙醇，在提取温度75℃、液固比1∶15、乙醇体积分数90%超声功率 480W条件下提取25 min，提取液过滤，真空浓缩，加水混匀后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空浓缩后再干燥至恒重，得超声提取提取的女贞子总三萜。

三种提取方法的总三萜得率比较见图6。

表1　因素与水平表

表2　正交实验结果

表3　方差分析结果

图6三种提取方法的比较

由图6可见，回流提取和超声提取的得率分别是5.82%和5.68%，三种提取方法的时间分别是超高压提取4 min ,超声提取25 min，回流提取120 min。超高压提取方法的得率较回流提取得率高，且提取时间较超声提取和回流提取时间短。

3讨论

超高压提取总三萜得率高，时间短，是由于植物在超高压下，细胞快速发生形变，当压力突然泄除后，细胞内外的压差变化，导致细胞快速破坏，使得细胞内的三萜成分溶出过程的传质阻力减小，得率得到提高[22]。但在超高压下，提供的能量不会破坏共价键，因此，三萜成分不会破坏。

在超高压提取植物有效成分的过程中，粉碎度、超高压压力、保压时间、固液比和溶剂浓度是影响提取得率的主要因素。本实验得到超高压提取女贞子总三萜的最佳工艺条件为：粉碎度60目、超高压压力400 MPa 、时间4 min和固液比1∶15。在最佳的提取条件下，女贞子总三萜得率可达6.08%，回流提取和超声提取的得率分别是5.82%和5.68%，三种提取方法的时间分别是超高压提取4 min ,超声提取25 min，回流提取120 min,超高压提取方法的得率较回流提取得率高，且提取时间较超声提取和回流提取时间短。因此，超高压提取方法是女贞子总三萜提取的适宜方法。

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Extraction conditions optimization of total triterpenes by ultra high pressure from Fructus Ligustri Lucidi

WANG Xue-zhu1,WU Shun-hong2,ZHAO Guang-yuan2

(1.HenanProvincialFoodandDrugInspectionCenter;2.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou,Henan450000,China)

Abstract:Objective To optimize extraction conditions of total triterpenes by ultra high pressure from Fructus Ligustri Lucidi and comparing with reflux extraction and ultrasonic extraction method . Methods Using Fructus Ligustri Lucidi as material and yields of total triterpenes as indexes, extraction conditions such as grinding degree, pressure, time, and the ratio of solid to liquid were optimized by signal factors test and orthogonal test.Conclusions Optimum extraction conditions were as follows: grinding degree 60 mesh, pressure 400 MPa, time 4 min and stock ratio 1∶15 (g∶mL). Under optimum extraction conditions, the yield of total triterpenes was 6.08%.The yield of reflux extraction and ultrasonic extraction were 5.82% and 5.68%, respectively. Conclusions Ultra high pressure extraction method has higher yield than the yield of reflux extraction and ultrasonic extraction method, and has shorter time than reflux extraction and ultrasonic extraction method. So, Ultra high pressure extraction method was a suitable method for total triterpenes extraction from Fructus Ligustri Lucidi.

Key words:Fructus Ligustri Lucidi;total triterpenes;ultra high pressure extraction;technology optimization

(收稿日期：2016-01-18，修回日期：2016-02-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.007

基金项目：2015年河南省创新型科技团队项目(No C20150024)