月桂酰基谷氨酸钠促进油污染生物修复的作用机制

高菱悦，张　楠，陈波水，欧益希，洛桑银巴

(1.后勤工程学院军事油料应用与管理工程系，重庆 401311；2.后勤工程学院国防建筑规划与环境工程系，重庆 401311；3.后勤工程学院军事土木工程系，重庆401311；4.95526部队，拉萨850000)



月桂酰基谷氨酸钠促进油污染生物修复的作用机制

高菱悦1，张楠2，陈波水1，欧益希3，洛桑银巴4

(1.后勤工程学院军事油料应用与管理工程系，重庆 401311；2.后勤工程学院国防建筑规划与环境工程系，重庆 401311；3.后勤工程学院军事土木工程系，重庆401311；4.95526部队，拉萨850000)

摘要：以十二烷基环己烷模拟矿物润滑油、以混合菌群为降解微生物，采用气相色谱法考察月桂酰基谷氨酸钠对十二烷基环己烷生物降解性的影响；采用气质联用仪、紫外可见分光光度计和表面张力仪分别对降解产物、降解过程中微生物生长情况以及月桂酰基谷氨酸钠对培养基油/水界面张力的影响进行分析，解析了月桂酰基谷氨酸钠促进十二烷基环己烷生物降解的作用机制。结果表明，生物降解过程中，月桂酰基谷氨酸钠先降解；月桂酰基谷氨酸钠可减小油/水界面张力，还可为微生物提供营养，加速微生物生长，两方面作用共同促进十二烷基环己烷生物降解。

关键词：月桂酰基谷氨酸钠；矿物润滑油；十二烷基环己烷；生物降解；生物修复；作用机制

随着合成润滑油的不断发展，以矿物润滑油为代表的润滑油逐渐取代了动植物润滑油成为最重要的润滑油品种。石油炼制技术及添加剂工业的不断发展，使润滑油性能有了很大的提高，满足了人类社会不断发展的需要。然而，在提高润滑油使用性能的同时，对其生态效能有所忽视，如以矿物润滑油为代表的生物难降解润滑油及大量有毒添加剂的使用对生态系统造成了较大的破坏[1]。

近年来，世界范围内润滑油环境友好化的呼声日益高涨，提出了“润滑、环保、节能”的现代润滑新理念。研究改善矿物润滑油生物降解性的新方法，对减少矿物润滑油对生态环境的危害具有重要的理论意义和应用价值[2]。课题组[3-4]前期研究发现，将月桂酰基谷氨酸、油酸二乙醇酰胺磷酸酯等含N和(或)P元素的化合物以适当比例加到矿物润滑油中，不仅能改善润滑油的某些使用性能，还可在一定程度上提高其生物降解性，但有关含N和(或)P化合物促进矿物润滑油生物降解的作用机制尚缺乏深入研究。为了提高月桂酰基谷氨酸在水基培养基中的溶解性，同时也为了规避多组分矿物润滑油引起的化学解析复杂性，作者在此以月桂酰基谷氨酸钠为生物降解促进剂、以十二烷基环己烷为矿物润滑油模拟物，研究了月桂酰基谷氨酸钠促进矿物润滑油生物降解的作用机制。

1实验

1.1菌种、试剂与仪器

混合降解菌：由课题组从石油污染土壤中分离、鉴定的5株菌(假单胞菌属、苍白杆菌属、博德特氏菌属、戈登氏菌属和铜绿假单胞菌[5])经人工驯化后组成。

正己烷，色谱纯，成都科龙化工试剂厂；十二烷基环己烷(C18)，日本东京化成工业株式会社；月桂酰基谷氨酸钠(SLG)，上海中狮科技发展有限公司。其它试剂均为市售分析纯。

7890A型气相色谱仪(GC)、7890A/5975C型气质联用仪(GC-MS)，美国Agilent公司；JYW-200C型全自动表/界面张力仪，承德鼎盛试验机检测设备有限公司；Alpha-1506型紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1培养基及菌悬液的配制

无机盐培养基：NaCl 0.1 g，NH4NO30.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.01 g，CaCl20.05 g，KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液调节pH=7.0，蒸馏水定容至100 mL，121 ℃蒸汽灭菌20 min。

C18富集培养基：在100 mL无机盐培养基中加入0.4 g C18。

LB培养基：胰蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，蒸馏水定容至100 mL，5 mol·L-1的NaOH调节pH=7.0，121 ℃蒸汽灭菌20 min；固体培养基需加琼脂粉2 g。

菌悬液：采用湿重法配制菌悬液作为生物降解实验的接种微生物。将上述5株菌分别复活于LB琼脂平板上，挑单菌落至LB液体培养基中，于(30±2) ℃、200 r·min-1摇床中振荡培养24 h，8 000 r·min-1高速离心8 min，去上层清液，称菌体湿重。用无菌生理盐水配制质量分数为10%的菌悬液。将5株菌的菌悬液混合即得混合菌悬液，其中，每株菌占混合菌悬液体积的1/5[5]。

1.2.2降解菌的驯化

为提高菌株对C18的降解率，对5株降解菌进行人工驯化[6]。将5株菌分别接种于LB琼脂平板上，32 ℃培养3 d，取平板上单菌落至C18富集培养基中，于(30±2) ℃、200 r·min-1摇床中振荡培养10 d后，取2 mL培养液于新鲜的C18富集培养基中，再重复培养2次，每次10 d。用接种环取末次培养的C18富集培养液于LB琼脂平板上分区划线，用含甘油培养物保藏法于-70 ℃保存菌种，备用。

1.2.3生物降解性实验

采用气相色谱仪测定SLG对C18生物降解性的影响。

(1)C18标准曲线的绘制

采用外标法[7]绘制C18标准曲线：分别配制浓度(g·mL-1)为0.02、0.06、0.08、0.13的C18标准溶液，正己烷标定，混合后进样，采用气相色谱测定峰面积，Excel软件绘制C18标准曲线并拟合回归方程。色谱条件为：HP-5色谱柱，载气(N2)流速30 cm·s-1，进样口温度280 ℃，FID检测器温度300 ℃，进样口分流比10∶1，进样量2 μL，初始柱温60 ℃保留1 min，再以15 ℃·min-1的速度升温至240 ℃，最后以10 ℃·min-1的速度升温至300 ℃保留1 min。

(2)样品预处理

在100 mL无机盐培养基中，依次加入0.1 g C18、0.1 g SLG和1 mL混合菌悬液，于(30±2) ℃、200 r·min-1摇床中振荡培养。取出样品，依次加入15 g NaCl、10 mL正己烷和100 μL 6 mol·L-1的HCl，于(30±2) ℃、200 r·min-1摇床中振荡30 min，静置于分液漏斗，分层后取上层溶液置于25 mL消解管中，加入2 g无水Na2SO4，摇匀，放入5 ℃冰箱中静置1 d。

(3)C18生物降解率的测定

采用气相色谱测定C18生物降解率：分别在培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d时取样，按(2)制备待测样品，进样测定，色谱条件同(1)，计算C18生物降解率。

1.2.4降解产物分析

采用气质联用仪分析降解产物：分别在培养4 h、8 h、12 h时取样，按(2)制备待测样品，进样测定。气相色谱条件：HP-5色谱柱，初始柱温60 ℃保留1 min，再以15 ℃·min-1的速度升温至240 ℃，最后以10 ℃·min-1的速度升温至300 ℃保留1 min；质谱条件：接口温度260 ℃，电子能量70 eV，电离方式EI，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描范围50～400 amu。

1.2.5微生物生长特性考察

采用紫外可见分光光度计考察微生物生长情况：将0.1 g C18、0.1 g SLG和1 mL混合菌悬液加到100 mL无机盐培养基中，以不添加SLG的无机盐培养基作为空白样，于(30±2) ℃、200 r·min-1摇床中振荡培养12 d。每隔2 d取样，用紫外可见分光光度计在600 nm处测定培养基的吸光度(OD600)，重复测定3次取平均值。

1.2.6油/水界面张力测定

按1.2.5培养微生物，每隔2 d取样，4 000 r·min-1离心10 min后取上层清液，采用表/界面张力仪测定其油/水界面张力[8]，重复测定3次取平均值。

2结果与讨论

2.1C18标准曲线(图1)

由图1可知，拟合线性方程为y=428 096x-419.38，相关系数R2=0.9867，表明C18浓度与峰面积呈良好的线性关系。通过回归方程可计算不同峰面积对应的C18浓度。

2.2SLG对C18生物降解率的影响(图2)

由图2可知，降解8 d，C18及添加SLG的C18的生物降解率均达到65%以上，表明驯化后的混合菌群对C18有较好的降解效果。降解第1 d，添加SLG的C18降解率即达到25.27%，而未添加SLG的C18降解率仅为2.82%；降解前3 d，未添加SLG的C18降解率升速缓慢，且降解率明显低于添加者；降解第3 d时，未添加SLG的C18降解率仅为9.37%，而添加SLG的C18降解率已达55.58%；降解第8 d时，添加SLG的C18降解率为79.68%，未添加SLG的C18降解率为69.45%。表明，SLG能提高C18的生物降解率，促进C18的生物降解。

图1C18标准曲线

Fig.1Standard curve of dodecylcyclohexane

图2　SLG对C18生物降解率的影响

2.3SLG促进C18生物降解的作用机制

2.3.1降解产物分析

在C18培养基中添加SLG后，降解4 h、8 h和12 h时的GC-MS图谱如图3所示。

图3　降解产物的GC-MS图谱

由图3可知，培养4 h时检测到月桂酸(C12H24O2)，而培养8 h、12 h时均未检测到月桂酸，由此推断SLG 8 h即可完全降解。因SLG具有中度耐盐及耐水性，降解过程处于缓冲溶液体系中，维持pH值接近中性不会导致SLG的自身水解。由此推断，在生物降解初期，SLG含有与蛋白质相似的酰胺键，可作为微生物的营养物质，易被微生物降解利用，因此在降解初期微生物先与SLG作用，直至微生物将其完全降解，且降解速度快。由图3还可看出，降解12 h内，C18的GC-MS图谱信号均较强，表明培养基中C18含量较高。结合图2结果可知，混合菌群先降解SLG，待SLG降解完毕再降解C18。

2.3.2微生物生长情况

C18及添加SLG的C18培养基溶液在600 nm处的吸光度(OD600)随降解时间(t)的变化如图4所示。

图4　培养基的吸光度随降解时间的变化

OD值可直观地反映微生物的生长情况，OD值越大，表明微生物数量越多，生长情况越好。由图4可知，微生物在添加SLG的C18培养基中前4 d处于指数生长期，在未添加SLG的C18培养基中前6 d处于指数生长期，而后均进入稳定期；添加SLG的C18培养基的最大OD值明显高于未添加者并提前达到最大值。这是因为，SLG先于C18降解，SLG可为微生物生长提供营养，促进微生物生长，提前进入指数生长期，从而加速对C18的降解[3，9]。

2.3.3油/水界面张力的变化

C18及添加SLG的C18培养基溶液的油/水界面张力(σ)随降解时间(t)的变化如图5所示。

由图5可知，随着降解的进行，2种培养基的油/水界面张力均不断下降，6 d后降幅趋缓；添加SLG的C18培养基溶液的油/水界面张力明显低于未添加者。表明，SLG与模拟油C18中界面活性组分产生了协同效应，SLG为阴离子表面活性剂，可有效降低油/水界面张力，增大难溶底物C18的溶解度，使油状物的大颗粒分散为小颗粒，增大了微生物与C18的接触面积，从而促进C18的生物降解[10-11]。

图5　培养基的油/水界面张力随降解时间的变化

烃类化合物(如长碳链的环烷烃)在降解过程中，其憎水性是微生物进行代谢、降解的主要障碍，而SLG作为一种表面活性剂，可促进烃类乳化并被动扩散进入细胞内，加速烃类物质降解。同时，SLG含有N、P元素，还可在微生物降解C18的过程中为其提供养分，促进微生物生长，提高难降解底物的生物降解性能[12-13]。

3结论

以十二烷基环己烷模拟矿物润滑油、以混合菌群为降解微生物，采用气相色谱法考察月桂酰基谷氨酸钠对十二烷基环己烷生物降解性的影响。结果表明，驯化后的混合菌群可有效降解C18，降解率可达79.68%；在添加SLG的C18培养基中，混合菌群先降解SLG，待SLG降解完毕再降解C18；SLG可提高混合菌群对C18的生物降解率，主要归因于两方面：一是SLG可为微生物提供营养，使微生物大量繁殖，提前进入指数生长期，提高C18的降解率；二是具有表面活性的SLG可降低培养基溶液的油/水界面张力，增大微生物与C18的接触面积，促进C18的生物降解。

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Mechanism of Enhanced Bioremediation of Oil Pollution by Sodium Lauroyl Glutamate

GAO Ling-yue1，ZHANG Nan2，CHEN Bo-shui1，OU Yi-xi3，LUOSANG Yin-ba4

(1.DepartmentofOilApplication&ManagementEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;2.DepartmentofMilitaryArchitecturalPlanning&EnvironmentalEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;3.DepartmentofCivilEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;4.Unit95526,Lhasa850000,China)

Abstract：Using dodecylcyclohexane as a model mineral lubricating oil,mixed microflora as degradation microorganisms,the effects of sodium lauroylg lutamate(SLG) on biodegradation of dodecylcyclohexane were investigated by gas chromatography.Furthermore,the biodegradation products,the growth of microorganisms in degradation process and the oil/water interfacial tension of the culture media were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),UV-visible spectrophotometer and surface tensionmeter.The mechanism of enhanced biodegradation of dodecylcyclohexane by SLG was also analyzed.Results indicated that,SLG primarily decomposed during biodegradation process,then SLG could enhance biodegradation of dodecylcyclohexane by reducing the oil/water interfacial tension and promoting growth of microorganisms as nutrient.

Keywords：sodium lauroyl glutamate;mineral lubricating oil;dodecylcyclohexane;biodegradation;bioremediation;mechanism

中图分类号：X 506

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)04-0022-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.006

作者简介：高菱悦(1991-)，女，辽宁沈阳人，硕士研究生，研究方向：环境友好润滑剂，E-mail：18611989249@163.com；通讯作者：陈波水，教授，博士生导师，E-mail：boshuichen@163.com。

收稿日期：2015-12-15

基金项目：国家自然科学基金资助项目(50975282)，重庆市自然科学基金资助项目(OSTC，2014JCYJAA50021)