黄 牛
(武汉大学基础医学院生物医学工程学,湖北 武汉 430071)
姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞细胞周期、凋亡及Bcl-2表达的影响
黄牛
(武汉大学基础医学院生物医学工程学,湖北 武汉 430071)
摘要:目的 探讨姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞细胞周期、凋亡及Bcl-2表达的影响。方法 采用不同浓度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)、不同时间(24h、48h、72h)姜黄素处理人骨肉瘤U-2OS细胞,分别采用MTT法、流式细胞仪及western blot检测细胞增殖、细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达。结果 姜黄素对U-2OS细胞体外增殖具有显著的抑制作用,并呈现剂量及时间依赖性。随着姜黄素浓度及作用时间的增加,G0-G1期细胞所占比率显著增高。姜黄素对U-2OS细胞凋亡具有显著的促进作用,并呈现剂量及时间依赖性。姜黄素处理后U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达显著降低,且其降低程度与姜黄素浓度呈正相关。结论 姜黄素可通过剂量依赖与时间依赖,促进骨肉瘤U-2OS细胞G0-G1期阻滞,从而诱导骨肉瘤U-2OS细胞凋亡,调节凋亡相关基因Bcl-2低表达是其可能作用机制。
关键词:姜黄素;骨肉瘤;凋亡;细胞周期;Bcl-2
骨肉瘤是临床常见的恶性骨肿瘤之一,好发于青少年,其对放、化疗等治疗方案敏感性较低,预后较差。因此,探讨更有效的骨肉瘤防治措施是近年来临床研究的热点难点。姜黄素是由姜科黄属植物姜黄根茎中提取的多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等多种生物学活性[1]。近年来研究表明,姜黄素可诱导多种体外培养的肿瘤细胞如胃癌[2]、肝癌[3]及结肠癌[4]等的凋亡,但其对人骨肉瘤的作用鲜见报道。为探讨姜黄素对人骨肉瘤细胞的作用,本研究采用体外培养方法,观察不同浓度、不同时间姜黄素处理对人骨肉瘤U-2OS细胞凋亡、细胞周期及Bcl-2表达的影响,旨在为骨肉瘤的临床治疗提供可靠理论依据。
1材料与方法
1.1材料姜黄素、MTT(Sigma公司);人骨肉瘤U-2OS细胞株(ATCC细胞库,美国);胎牛血清、DEME培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶(Gibco公司);Annexin-V-FITC凋亡试剂盒(Beckman coulter公司);Bcl-2兔抗人多克隆抗体(Santa Cruz公司)。
1.2细胞培养复苏人骨肉瘤U-2OS细胞株,PBS洗涤3次,DMEM培养基洗涤3次,用含有10%胎牛血清、0.1g/L链霉素、105U/L青霉素DMEM培养液将细胞混匀,37℃、5% CO2培养箱中培养,每天换液1次。收集对数生长期细胞,采用不同浓度姜黄素(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)和不同时间(24h、48h、72h)对人骨肉瘤U-2OS细胞进行处理。
1.3姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用胰酶消化人骨肉瘤U-2OS细胞,PBS缓冲液洗涤3次,800rmp 离心10min,弃上清,DMEM培养基调整细胞浓度为2×105个/ml,将细胞加至96孔培养板,200μl/孔。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养2h,加入姜黄素,终浓度分别为0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml,每孔设3个复孔,共5组。细胞置于37℃、5% CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h,培养结束时,加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,37℃、5% CO2培养箱4h,800rmp离心10min,弃上清,加入酸化异丙醇180μl/孔,震荡使紫色结晶溶解,酶标仪测OD570nm吸光值。
1.4姜黄素处理后U-2OS细胞形态变化倒置显微镜下观察不同浓度姜黄素处理72h后U-2OS细胞形态变化。
1.5细胞凋亡率及细胞周期检测采用同“方法1.3”相同方法培养细胞,培养结束后,800rmp 离心10min,弃上清,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期,操作步骤严格按试剂盒说明书进行。
1.6Bcl-2蛋白表达检测采用westernblot检测Bcl-2蛋白表达。收集不同浓度姜黄素培养72h后的U-2OS细胞,提取其胞质蛋白,行SDS-PAGE电泳,转至硝酸纤维膜,5%封闭液4℃封闭4h,TBS缓冲液漂洗3次,加入Bcl-2兔抗人多克隆抗体(1∶1000),4℃孵育过夜,TBS缓冲液漂洗3次,加入相应二抗(1∶500),室温孵育2h,增强化学发光显色系统显色。
2结果
2.1姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用姜黄素对U-2OS细胞体外增殖具有显著的抑制作用。在同一时间条件下,姜黄素浓度越高则U-2OS细胞增殖抑制作用越明显(P<0.05);在同一浓度条件下,姜黄素处理时间越长则U-2OS细胞增殖抑制作用越明显(P<0.05)。提示姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性,见表1。
表1 不同浓度姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用±s,n=3)
与对照组比较,*P<0.05;与24h组比较,#P<0.05
2.2姜黄素处理后U-2OS细胞形态变化倒置显微镜下可见未经姜黄素处理的U-2OS细胞状态良好,折光性佳,排列紧密。随着姜黄素处理浓度的增大,U-2OS细胞数量逐渐减少,折光性差,排列疏松,附壁性减弱,且有部位细胞形态变为圆形,偶见凋亡细胞碎片。
2.3姜黄素对U-2OS细胞周期的影响在同一时间条件下,姜黄素浓度越高则U-2OS细胞G0-G1期细胞所占比率越高,S期、G2期细胞所占比率越低(P<0.05);在同一浓度条件下,姜黄素处理时间越长则G0-G1期细胞所占比率越高,S期、G2期细胞所占比率越低(P<0.05)。提示姜黄素可使U-2OS细胞停滞于G0-G1期,从而抑制U-2OS细胞体外增殖,并呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性,见表2。
表2 不同浓度姜黄素对U-2OS细胞周期的影响±s,n=3)
与对照组比较,*P<0.05;与24h组比较,#P<0.05
2.4姜黄素对U-2OS细胞凋亡的影响姜黄素对U-2OS细胞凋亡具有显著的促进作用。在同一时间条件下,姜黄素浓度越高则U-2OS细胞凋亡率越高(P<0.05);在同一浓度条件下,姜黄素处理时间越长则U-2OS细胞凋亡率越高(P<0.05)。提示姜黄素对U-2OS细胞凋亡促进作用呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性,见表3。
表3 不同浓度姜黄素对U-2OS细胞凋亡率的影响±s,n=3)
与对照组比较,*P<0.05;与24h组比较,#P<0.05
2.5姜黄素对U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达的影响姜黄素处理72h后U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达显著降低,且其降低程度与姜黄素浓度呈正相关,见图1。
图1 姜黄素处理后U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达
3结论
细胞凋亡是指细胞为维持机体内环境稳定,在基因控制下进行的有序性、自主性死亡。与细胞坏死的被动过程不同,细胞凋亡是一个主动过程,并与一系列基因的激活、表达及调控密切相关[5]。Bcl-2基因家族包括抑制细胞凋亡基因如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W及促进细胞凋亡的基因如Bax、Bcl-Xs等,该家族在调控细胞凋亡过程中具有十分重要的作用。既往研究证实[6],Bax过表达可显著促进细胞凋亡,但抑制Bcl-2等抑制细胞凋亡基因的过表达可起到促进Bax引起的细胞凋亡的作用。
姜黄素作为多效性天然活性物质,不仅可保护机体正常细胞免受损伤,也可通过多途径抑制肿瘤细胞增殖。肖扬等[7]以阿霉素为诱导药物,采用阿霉素大剂量冲击法建立人骨肉瘤U-2OS细胞耐药模型(U-2OS/ADM),并在此基础上探讨姜黄素对细胞多药耐药性的细胞作用,结果显示姜黄素可有效增加阿霉素对U-2OS/ADM的细胞毒作用,从而逆转U-2OS/ADM细胞的多药耐药现象。范全等[8]采用姜黄素处理人骨肉瘤U2OS细胞,可显著抑制细胞体外增殖并诱导细胞凋亡,且其作用呈剂量依赖性,与本研究结果一致。恶性肿瘤的发生与发展和肿瘤细胞的增殖与凋亡密切相关,细胞凋亡具有负向调节作用,从而有效抑制肿瘤生长[9]。因此,如何诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的新方向。磷脂酰丝氨酸(PS)作为凋亡细胞表面分子充分暴露于凋亡细胞膜外,因此采用PS结合Annexin对细胞凋亡进行检测是目前最理想的细胞凋亡定量检测方法。流式细胞仪PI染色法结果显示,姜黄素可显著促进U-2OS细胞凋亡,并呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性,且大多数细胞阻止于G0-G1期,这可能与姜黄素对DNA合成的抑制作用有关。采用westernblot检测Bcl-2蛋白表达,结果显示经姜黄素(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)作用72h后,U-2OS细胞中Bcl-2蛋白表达随姜黄素浓度增加而显著降低,提示姜黄素降低Bcl-2蛋白表达是其促进U-2OS细胞凋亡的可能作用机制之一。
本研究结果显示姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞的作用呈现明显的时间和浓度依赖性,所以随浓度升高,作用越强。若今后在临床应用过程中,姜黄素可能会对人体其他正常细胞产生一系列作用,再研究其最佳浓度。姜黄素作为潜在的治疗骨肉瘤(尤其是对化疗药物多药耐药性骨肉瘤)的化疗药物,其作用机制需进一步深入研究。
参考文献:
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[7]肖扬,王万春.姜黄素对人骨肉瘤细胞株/阿霉素多药耐药逆转作用的实验研究[J].卫生研究,2011,40(1):103
[8]范全,原向伟,马俊辉.姜黄素诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡的实验研究[J].华中科技大学学报(医学版),2008,37(4):538
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Effect of Curcumin on Cell Cycle,Apoptosis and Bcl-2 Expression in Human Osteosarcoma U-2OS Cells
HUANG Niu
(DepartmentofbasicMedicalSciences,WuhanUniversity,WuhanHubei430071,China)
ABSTRACT:Objective To evaluate the effect of curcumin on cell cycle,apoptosis and Bcl-2 expression in human osteosarcoma U-2OS cells. Methods U-2OS cells were treated with different time(24h,48h or 72h)and different concentrations(10μg/ml,50μg/ml,100μg/ml or 200μg/ml)of curcumin.The cell proliferation,apoptosis and the Bcl-2 protein expressionwere determined by MTT method,flow cytometry and western blot,respectively.Results A time-dependent and dose-dependent growth inhibition of U-2OS cells was shown after exposure to curcumin.With the increase of curcumin concentration and action time,proportion of G0-G1 phase cells was increased significantly,,the Bcl-2 protein expression was obviously reduced,and was positively correlated with the concentration of curcumin.Conclusion Curcumin can induce apoptosis of human osteosarcoma U-2OS cells through the initiation of G0-G1 phase arrest and inhibiting mitosis in dose-dependent and time-dependent manner.Down-regulation of Bcl-2 gene may be the mechanism of apoptosis.
KEY WORDS:Curcumin;Osteosarcoma;Apoptosis;Cell cycle;Bcl-2
(收稿日期:2016-01-03)
DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.099
中图分类号:R285.5
文献标识码:A
文章编号:2095-4646(2016)02-099-04